基于數據挖掘和網絡藥理學的丹參配伍規律及其防治冠心病作用機制研究?

周文靜，朱 彥，郭怡含，李志勇，周榮榮,，柴 智，王永輝△

(1. 山西中醫藥大學基礎醫學院，山西 晉中 030600； 2. 中國中醫科學院中醫藥信息研究所，北京 100700；3. 山東中醫藥大學中醫學院， 濟南 250355； 4. 中央民族大學藥學院，北京 100081)

丹參為唇形科植物丹參(SalviamiltiorrhizaBge)的干燥根和根莖，首載于《神農本草經》，其味苦、性微寒，歸心、肝經，具有活血化瘀、通經止痛、清心除煩、涼血消癰等功效[1]。主要化學成分為丹參酮、丹參酚酸類、揮發油及無機元素[2]。丹參有保護血管內皮細胞、抗心律失常、抗動脈粥樣硬化、改善微循環等作用[3]，常用于心腦血管病，是臨床治療冠心病(coronary heart disease，CHD)的主要中藥之一，療效肯定[4]。中藥發揮作用的一大優勢就是藥物配伍，丹參應用歷史悠久，方劑眾多，因此挖掘丹參的配伍應用規律，突出丹參配伍后的多成分協同作用，對進一步提高丹參臨床應用率具有重要意義。

近年來，隨著計算機技術的高速發展，孕育而生的數據挖掘技術[5]與網絡藥理學[6]等技術方法在醫藥各方面發揮著越來越重要的作用。本研究采用數據挖掘和網絡藥理學相結合的方法，挖掘與分析丹參在方劑中的配伍規律，進一步從網絡藥理學微觀角度探討丹參藥對防治冠心病的分子機制，為系統化研究丹參這一藥物并將其更好地運用于臨床提供科學依據。

1 資料與方法

1.1 文獻檢索

方劑來源于中國中醫科學院信息研究所中國中醫藥數據庫(http://cowork. cintcm. com/ engine/windex.jsp)。

1.2 數據清洗[7]

所選方劑為1911年前古代醫籍收載方劑，且明確是內服(湯劑、丸劑、散劑)方劑，選取時剔除只有1味藥的方劑以及組成中藥物不明確的方劑。參照《中國藥典》2015年版[1]與十三五規劃教材《中藥學》[8]對所錄入中藥名稱進行規范化處理，剔除劑量、藥物炮制信息、描述性前綴詞，將藥名規范化納入進行數據整理。

1.3 數據挖掘

采用開源工具R (V3.4.0)語言arules包(https://cran.r-project.org/web/ packages/arules/)對含丹參方劑進行關聯規則分析。其中支持度(Support)高的對藥為頻繁對藥數據集；置信度(Confidence)越高藥對關系越緊密，滿足提升度(Lift)大于1，關聯規則才有意義[9]。本研究以Lift>1，Confidence≥ 93%，按Support值降序排列選取丹參高頻藥對數據。

1.4 丹參藥對作用靶標預測

在中藥系統藥理學分析平臺(TCMSP)數據庫[10](http://ibts. hkbu. edu. hk/LSP/ tcmsp. php)，搜集含丹參高頻對藥的中藥化學成分，以口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥ 0.18為中藥活性成分篩選條件，并獲得活性成分的預測靶標。利用Uniprot數據庫(http:// www. Uniprot.org)查詢、驗證靶標信息，并統一為基因名稱。

1.5 疾病靶標獲取

采用人類基因數據庫Gene Cards(http://www.genecards.org/)和在線人類孟德爾遺OMIM(http://omim.org/)數據庫，以“coronary heart disease”為檢索詞，獲取冠心病的疾病靶標。并在Uniprot數據庫設定生物物種為homo sapiens (human)，統一基因名稱，刪除重復項。

1.6 靶點相互作用及核心靶點篩選

在1.5基礎上，將丹參藥對化合物對應的所有靶標通過軟件Cytoscape 3.2.1中“Network analyzer”功能進行拓撲屬性分析，按度值Degree值取中位數。進一步利用STRING數據庫(https://string-db.org)獲取蛋白相互作用(PPI)網絡，通過Cytoscape 3.2.1軟件進行可視化展示，尋找關鍵靶點。

1.7 基因本體與通路富集分析

利用R Project中的org.Hs.eg.db包(http://www. bioconductor. Org/packages/release/ data/annotation/html/ org.Hs.eg.db.html)，將基因symbols轉變為Entrez IDs ，進而利用cluster Profiler包3.6版(http://bioconductor. org/packages/release/ bioc/ html/cluster Profiler. html)對核心靶標進行GO(gene ontology)注釋和KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路富集分析，將P值設置為小于0.01。

1.8 分子對接驗證

在1.6基礎上，選擇拓撲參數度值前5的關鍵靶標，與相對應的活性成分以及治療冠心病的陽性對照藥洛伐他汀(Lovastatin)進行分子對接驗證。在Systems Dock Web Site(http:// systems dock. unit. oist.jp/iddp/ home/ index)分析平臺輸入活性成分3D結構，按照提示步驟進行分子對接并保存結果，對docking score進行分析。

2 結果

2.1 關聯規則分析

表1示，經過文獻整理篩選出含丹參方劑共773首，利用R語言從中篩選獲得550組對藥數據。按Support≥ 1%且Confidence≥ 93%、Lift> 1，篩選含丹參的對藥數據115個。根據Support值由大到小排序，排名前5位的高頻對藥分別是{人參}=>{丹參}、{防風}=>{丹參}、{川芎}=>{丹參}、{芍藥}=>{丹參}、{肉桂}=>{丹參}，將這5組對藥中的藥物認為是與丹參作用密切的藥物。其中芍藥有赤芍、白芍2種，由于明代以前的醫籍中沒有明確赤白之分[11]，在進一步的網絡藥理學分析中，選取活血化瘀作用較好的赤芍與丹參進行配伍研究。

表1 含丹參高頻藥對之間的關聯規則分析

2.2 丹參藥對潛在靶點與冠心病已知靶點篩選

表2圖1示，預測丹參藥對化合物的潛在作用靶點，其中丹參作用靶點1763個，人參562個，川芎1039個，防風1096個，赤芍528個，肉桂448個，發現丹參與其他藥物均有共性靶點。其中丹參與防風、赤芍、川芎共性靶點較多，說明有較強的協同作用；而丹參與肉桂共性靶點最少，協同作用較低。與此同時，檢索到冠心病疾病靶標63個，其中丹參藥對與疾病共有靶標12個，分別是MMP3、IL10、ALOX5、INS、CETP、IGF2、SELP、GLB1、AKR1B1、AR、CRP、NR3C1，推測丹參藥對可能通過上述靶點發揮協同治療作用。使用Cytoscape 3.2.1軟件，構建丹參藥對“藥對-靶點”關系圖，反映各藥對間的共同靶點關系?！胺里L-丹參”“川芎-丹參”與疾病共有靶點交互較多，所以丹參通過與川芎、防風等藥物配伍在治療冠心病中可能發揮重要作用。而“肉桂-丹參”與疾病共有靶點交互最少，治療作用較弱，進一步機制研究中將其剔除。

表2 丹參的高頻藥對之間共同靶點分析

圖1 丹參藥對與疾病共有靶點交互圖(淺色代表中藥，深色代表靶點)

2.3 丹參藥對防治冠心病關鍵靶點預測

圖2示，選取丹參分別與赤芍、川芎、防風、人參等對藥，按網絡拓撲中位數值選取255個潛在靶點，及已知靶點在STRING數據庫構建PPI網絡。使用Cytoscape 3.2.1軟件進行可視化處理，將Degree值前100位的靶點進行展示，越接近紅色表明網絡中節點與節點相連的數目越多，即Degree值越大。網絡拓撲值前10位靶點包括共有靶點INS(胰島素)，已知靶點TNF(腫瘤壞死因子)，潛在靶點MAPK1(絲裂原活化蛋白激酶1)、AKT1(RAC-α絲氨酸/蘇氨酸-蛋白激酶)、IL6(白細胞介素-6)、CAT(氯霉素乙酰轉移酶)、VEGFA(血管內皮生長因子A)、CASP3(半胱天冬酶3 )、JUN(轉錄因子AP-1)、MAPK1(絲裂原活化蛋白激酶1)、MMP9(基質金屬蛋白酶-9)。這些靶點可能是丹參藥對發揮作用的關鍵靶點，且靶點之間的關系密切，存在相互協同作用。

圖2 關鍵靶標網絡比較(三角形為共有靶點，圓形為潛在靶點，顏色越深表示越重要)

2.4 關鍵靶點GO、KEGG通路富集分析

圖3示，將丹參藥對治療冠心病關鍵靶標進行GO和KEGG通路分析。結果顯示，丹參藥對主要通過類固醇激素反應、羧酸生物合成、有機酸生物合成、氧化應激反應等生物過程(biological process，BP)，并結合輔酶、羧酸、有機酸、G蛋白偶聯乙酰膽堿受體活性、類固醇激素受體活性等分子功能(molecular function，MF)發揮作用。涉及KEGG通路包括流體剪切應力和動脈粥樣硬化通路(Fluid shear stress and atherosclerosis)、晚期糖基化終末產物及其受體(AGE/RAGE)信號通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)；免疫相關信號通路包括腫瘤壞死因子信號通路(TNF signaling pathway)，信號傳導通路包括血管內皮生長因子信號通路(VEGF signaling pathway)、IL-17信號通路(IL-17 signaling pathway)；感染性疾病信號通路如乙型肝炎(Hepatitis B)，癌癥信號通路如前列腺癌(Prostate cancer)。具體分析用Graph Pad Prism 5.0繪圖，提示丹參藥對的主要活性成分靶點通過多種生物過程、分子功能、不同的代謝途徑發揮作用。

圖3 GO富集分析和KEGG通路分析

2.5 分子對接驗證

圖4示，采用Systems Dock Web Site分析平臺進行分子對接驗證，其中對接結果評分docking score代表小分子與靶蛋白結合強度，一般認為docking score值在4.25以上表示分子與靶點之間有一定的結合活性，大于5.0分表明有較好的結合活性，大于7.0表明具有強烈的結合活性[16]。將排名前5的靶點INS、TNF、AKT1、IL6、CAT進行分子對接，由于TNF缺少相應的晶體結構未進行分子對接，結果顯示多數丹參藥對活性成分與重要靶點有較好的結合性，與陽性對照藥Lovastatin的docking score分值接近，證明預測靶點的可靠性及丹參藥對活性成分與靶點的良好結合活性。

圖4 丹參藥對主要化學成分和具體靶點對接結果

2.6 構建“中藥-成分-關鍵藥靶-通路”網絡

圖5示，最后構建“中藥-成分-關鍵靶點-通路”網絡圖。為更清晰直觀，僅選取KEGG通路富集分析結果前20名的通路以及網絡拓值前10位的靶點進行可視化展示，提示丹參藥對中同一藥物有多種化合物，不同藥物又有相同的化合物；同一化合物可以調節不同靶點，同一靶點也會參與不同的代謝通路，形成多靶點和多通路協同作用的特點。

圖5 “中藥-成分-靶點-通路”網絡比較

3 討論

冠心病屬于中醫學“胸痹”“心痛”等范疇，表現為“胸痹不得臥，心痛徹背”者，為一種臨床常見病、多發病，嚴重危害人類健康。中醫藥在改善冠心病臨床癥狀、延緩演變、改善預后方面具有獨特優勢和良好作用[3]。文獻研究治療冠心病方劑用藥規律，得出治療冠心病最常用的單藥就是丹參(共143次占54.40%)[13]，而與丹參配伍治療冠心病的藥物組成即是以活血化瘀藥為主，佐以益氣、祛瘀、通脈藥，如人參、川芎、赤芍[14]，而丹參與防風、肉桂用于冠心病治療報道較少。通過網絡藥理分析發現，“丹參-防風”為冠心病疾病靶點交互最多的藥對，可能在冠心病治療中發揮重要作用。從發病病因來看，冠心病多因痰瘀互結、日久郁而化熱、暗耗真陰，進而導致陽亢風動、風與痰瘀互結在一起形成風痰內動的病理證候[15]。風邪特性善行而數變，病人會出現病情反復發作、發病急劇、癥狀多種多樣的表現，類似于冠心病心絞痛“不穩定”型的特點[16]。防風功用祛風解表、勝濕止痛止痙，為風藥之潤劑，用于治療冠心病取其祛風以勝濕祛痰之功，且現代藥理研究防風可影響紅細胞和纖維蛋白的原量及功能，發揮活血化瘀作用[17]，所以防風既可祛風治標又可活血治因，可見丹參與防風的配伍亦是治療冠心病的重要組合。

網絡藥理學預測，丹參藥對防治冠心病關鍵靶標有INS、TNF、MAPK1、AKT1、IL6、CAT、VEGFA、CASP3、JUN、MAPK1、MMP9等。研究報道，INS抵抗是CHD等心血管疾病的病理基礎，不同區域的CHD患者其INS抵抗水平存在明顯差異[18]。同時局部或全身的炎癥反應在動脈粥樣硬化及其并發癥的發生發展中起重要作用[19]。TNF-α是一種有效的促炎細胞因子，IL-6為一種多效的細胞因子，在炎癥反應中起中樞性調節作用，并且IL-6與相應受體結合后可誘導基質金屬蛋白酶MMP-9的表達和釋放，促進平滑肌細胞的增殖[20-21]，而釋放MMP-9可提高炎癥單核細胞聚集與浸潤，又會刺激補體、TNF等物質生成，從而加重血管粥樣硬化及鈣化[22]。CAT是一種關鍵的抗氧化酶，可以抵御氧化應激反應，而氧化應激反應貫穿動脈粥樣硬化斑塊形成的始終[23]。KEGG通路分析主要涉及流體剪切應力和動脈粥樣硬化信號通路、AGE/RAGE、TNF、IL-17、VEGF信號通路以及感染性疾病通路等，形成多靶點、多途徑的作用特點，且相應的靶標又會映射于相關通路。以VEGF信號通路為例，血管內皮細胞功能障礙發生于動脈粥樣硬化的全過程[24]。網絡藥理學預測，映射于VEGF信號通路的關鍵靶點有AKT1、MMP9、MAPK1。研究表明，抑制內皮細胞Akt1加劇了缺氧誘導的體內血管重構[25]。VEGF可以增加MMP的表達，促進冠脈側支循環的形成[26]。VEGF誘導MAPK活化，在大鼠心臟缺氧模型中，p38MAPK被激活導致心肌細胞凋亡[27]，說明這些關鍵靶點在與冠心病相關的VEGF通路中確有作用。丹參藥對防治冠心病化學成分眾多，進一步分析化合物與關鍵靶點的關系。如與AKT1存在相互作用的化合物有丹參中木犀草素(luteolin)、丹酚酸A (salvianolic acida)、芹菜素(apigenin)；防風中的漢黃芩素(wogonin)；赤芍中黃芩素(baicalein)、芍藥酮(paeonol)；人參中的4，5，7-三羥黃酮醇(kaempferol)，且通過分子對接驗證，除漢黃芩素與芍藥酮與靶點AKT1對接得分小于4.0外，其余均大于5.0，有較好的結合活性且作用密切，體現了丹參藥對防治冠心病“中藥-化學成分-靶點-通路”增效協同的完整作用過程。

綜上所述，本研究通過數據挖掘得到5組丹參高頻藥對。網絡藥理學方法預測丹參高頻藥對防治冠心病的分子機制，丹參藥對主要作用于INS、TNF、MAPK1、AKT1、IL6等靶點，干預多種生物過程與分子功能，主要通過動脈粥樣硬化通路、TNF、AGE-RAGE、VEGF、IL-17等信號通路發揮作用。本研究不足之處，未對丹參藥對與冠心病的不同證型進行對應研究，且相關分子機制尚需基礎實驗驗證。