樹突狀細胞疫苗治療口腔鱗狀細胞癌的研究進展

裴天楚 黃隆 吳國惠 潘文娜 劉嘉敏 潘宣

廣東藥科大學附屬第一醫院口腔科（廣州510080）

口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinomas，OSCC）在頭頸部惡性腫瘤中發病率最高。腫瘤早期的患者通常接受手術治療，3年有效生存率可達92.2%（SE = 1.1），而晚期腫瘤患者接受手術協同放療或化療的綜合治療，3年有效生存率只有70.3%（SE = 1.9）［1］。免疫治療作為一種新的治療方案，一方面可以直接補充外源性免疫效應細胞或分子，提高機體內免疫應答水平，另一方面利用腫瘤免疫的機制和特點，改變腫瘤細胞或效應細胞的免疫學特性，調整機體免疫應答的狀態，達到抑制或殺傷腫瘤的目的［2］。目前樹突狀細胞疫苗在治療一些如黑色素瘤、胃腸道腫瘤、淋巴瘤等腫瘤的過程中取得了可觀的效果［3-4］。

1 樹突狀細胞是最活躍、扮演角色最多的免疫細胞

樹突狀細胞（dendritic cells，DC）由單核細胞分化而來，是人體內抗原呈遞能力最強的免疫細胞［5］。按來源可分為髓系DC（myeloid DC，mDC）和漿細胞樣DC（plasmacytoid DC，pDC）兩個亞群，在整個免疫應答過程中起著至關重要的作用。pDC 主要通過輔助性T 細胞介導的Ⅰ型免疫應答，在固有免疫中發揮重要作用［6］。mDC 在攝取處理抗原后可遷移至二級淋巴組織，從而啟動免疫應答并刺激分泌相關免疫因子參與免疫應答的環節［7］，制備疫苗選用的mDC 通常由骨髓分離出的單核細胞誘導分化而來。且樹突狀細胞膜上表達MHC-Ⅰ類和MHC-Ⅱ類分子，像自然界的蜜蜂一樣在免疫系統里扮演傳播抗原的媒介角色。未成熟DC 具有很強的抗原攝取及加工能力。當未成熟DC 在攝取抗原或經腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素（IL）等刺激后逐漸成熟，并表達共刺激因子（CD80/B7-1、CD86/B7-2 等）和黏附因子，使得抗原呈遞和激活初始T 細胞的能力增強。DC 還可以提供T 細胞活化所必須的第二信號，增強NK 細胞毒作用等［8-9］。

2 樹突狀細胞在OSCC 患者體內處于免疫抑制的狀態

免疫系統與腫瘤之間的關系可概述為免疫編輯的三個階段：消除、平衡和逃逸［10］。免疫系統能夠檢測并消除新出現的惡性細胞，防止它們不受控制地擴散。癌癥免疫監視是重要的宿主保護方式，可抑制細胞癌變以及維持正常細胞處于穩定的狀態。惡性腫瘤細胞可通過以下的機制逃避免疫監視：（1）免疫識別降低（包括腫瘤抗原表達水平降低和MHC、共刺激分子表達的喪失）；（2）通過STAT-3 信號傳導增加腫瘤細胞對凋亡的抗性；（3）細胞因子如血管內皮生長因子、TGF-β、白介素-10 的分泌和免疫調節分子如PD-1/PD-L1、TIM-3、LAG-3 的表達增加，均導致了惡性腫瘤的進展［11］。在腫瘤微環境中的樹突狀細胞功能受到明顯的抑制。HILLY［12］證實位于腫瘤周圍微環境和腫瘤瘤體內的抗原呈遞細胞和淋巴細胞處于一個低表達的水平，與此同時在OSCC 中的樹突狀細胞占比明顯低（11.7/HPF vs.25.0/HPF）。

樹突狀細胞與細胞的惡變和惡化有著密切的聯系，樹突狀細胞在調節先天性和適應性免疫以及抗腫瘤免疫中扮演了重要角色［13］。在頭頸部鱗癌（HNSCC）以及其他系統腫瘤中，樹突狀細胞的免疫能力同樣受到不同程度的抑制。不同于MHC-Ⅰ類分子和MHC-Ⅱ類分子，CD1a 也是一種抗原遞呈分子，主要在抗原遞呈細胞（APC）表面表達［14］。腫瘤周圍CD1a+標記的樹突狀細胞耗竭是一個獨立影響預后的因素，預示著更差的生存結果和更高的復發率［15］。在OSCC腫瘤間質中檢測到高水平漿細胞樣樹突狀細胞（pDC），但在對照組正常的口腔粘膜中卻很少或未檢測到pDC。機體帶瘤狀態下IFN-α、IL-6 和TNF-α等免疫因子分泌減少，造成pDC的數量減少和功能受損，從而導致更高的機率發生淋巴結轉移以及總生存率的顯著降低［16］。OSCC 患者癌組織中腫瘤浸潤性樹突狀細胞的密度、MHC-Ⅱ陽性以及CD54 陽性的細胞比例均降低，腫瘤直徑越大、腫瘤分期越靠后，腫瘤浸潤性樹突狀細胞的表達水平越低［17-18］。

3 樹突狀細胞疫苗在治療OSCC 過程中的探索

在樹突狀疫苗的初步探索階段，單次注射抗原脈沖DC 的制備疫苗足以在體內誘導抗原特異性免疫反應。樹突狀細胞疫苗治療OSCC 最早由WANG［19］用Tca8113 細胞裂解物刺激人類外周血單核細胞培養出的樹突狀細胞，激活自體的T 細胞，在體外進行MTT 分析結果顯示其對腫瘤細胞殺傷作用有效，并向荷瘤裸鼠給藥，發現推遲了裸鼠體內瘤體的倍增時間（P＜0.01），即在體內外腫瘤細胞的生長均受到了有效地抑制（P＜0.05）。國內最早有報道將外周血中提取的單核細胞，以免疫因子誘導成為成熟的樹突狀細胞，并接受腫瘤裂解物脈沖刺激，再與T 淋巴細胞混合培養來誘導出特異性細胞毒性T 細胞（CTL）。相比對照組，腫瘤細胞裂解物脈沖刺激DCs 能更有效地抑制腫瘤生長及延長腫瘤倍增時間（P＜0.05）［20］。

以往樹突狀細胞疫苗的制備通常采用自體外周血單核細胞誘導分化成樹突狀細胞與單一的特異性抗原肽或者腫瘤裂解產物進行共培養的方法，這種方法制備的疫苗免疫原性較低，為了提高樹突狀細胞攝取處理抗原的能力，GAO［21］實驗證實利用納秒脈沖電場（nsPEF）技術，采用適當電場強度能增強樹突狀細胞對腫瘤抗原的攝取與遞呈能力，并且激活了更多的效應細胞。樹突狀細胞在腫瘤的免疫治療中具備天然的優勢，WHITESIDE［22］用自體腫瘤凋亡抗原負載制備樹突狀疫苗，用于Ⅲ/Ⅳ期頭頸部鱗狀細胞癌患者，接種疫苗的患者長期無病生存率得到明顯提高，表明該疫苗有免疫原性且具備一定的安全性。DC 的直接瘤內給藥并結合放射治療，不僅可以對直接給藥的局部腫瘤產生強烈的抗腫瘤作用，通過激活GRP94/gp96 途徑，還可以對未治療的遠處腫瘤產生一定的抗腫瘤作用，即出現抗腫瘤的異位效應。但是皮內給藥途徑顯示，DC 向淋巴結的遷移率降低，經超聲引導的DC 疫苗接種又可能存在將疫苗注射到脂肪區域（瘤體外）的弊端［23］，所以影像醫生輔助疫苗接種將是一個很好的選擇。當受到宿主免疫系統攻擊時，腫瘤相關抗原可通過泛素化途徑在蛋白酶體中降解短壽蛋白（包括DRiPs），維持腫瘤細胞長期穩定生存的狀態。腫瘤細胞通過MHC-I 類分子遞呈的抗原多來自于自身降解的DRiPs（有缺陷的核糖體產物）。有研究用自噬誘導劑、蛋白酶體抑制劑、溶酶體抑制劑等處理OSCC細胞，誘導分離出大量自噬性抗原Dribbles（包含大量DRiPs 的泡狀自噬體），并用其負載DC，抗腫瘤效果要顯著優于腫瘤裂解產物脈沖刺激所制備的疫苗［24］。外泌體是一種納米級的細胞外小囊泡（30 ～150 nm），包含復雜的RNA 和蛋白質以及其他代謝物組分，廣泛應用于機體的免疫應答、抗原提呈、細胞遷移、細胞分化、腫瘤侵襲、體液調節等，被認為是細胞間通訊的重要介質［25］。樹突狀細胞外泌體同樣具有抗原提呈和激活CD8+T 細胞的能力［26］。戴欣悅［27］利用免疫檢查點抑制劑外體偶聯樹突狀細胞外泌體疫苗治療黑色素瘤，相比對照組抑制了原發癌的復發和轉移，并減弱了靶外效應，促進了免疫檢查點抑制劑的穩定。樹突狀細胞表面高表達甘露糖受體，殼聚糖-硬脂酸（stearic acid-grafted chitosan，CtSa）是一種糖脂嫁接后得到的產物，將甘露糖嫁接到CtSa可以得到MCt-SA（mannose modified stearic acid-grafted chitosan）。MCtSA 是一種較強的免疫佐劑，在模擬抗原捕獲試驗中有出色的表現。體外細胞攝取試驗證實［28］，甘露糖的靶向修飾后可促進DC 對MCtSA 的攝取，以此制備糖脂鈉米疫苗，提高了MHC-I 分子抗原呈遞能力，同時也增強了抗腫瘤效應。

4 樹突狀細胞疫苗治療過程中存在的瓶頸以及新的嘗試

當機體長期遭受腫瘤侵襲，機體免疫環境發生變化，免疫系統處于被抑制的狀態，樹突狀細胞的免疫能力相應出現下降，從而發生腫瘤細胞免疫逃逸現象。樹突狀細胞疫苗在體內外抗腫瘤的成果是有目共睹的，例如該疫苗在體外能有效地殺傷腫瘤細胞、使接種腫瘤裸鼠瘤體的倍增時間延長等。但當樹突狀細胞制備的疫苗接種到患者體內時，由于樹突狀細胞疫苗本身具有免疫原性容易激活自身免疫反應，從而使得疫苗未能達到預期的治療效果［29］。

許多研究者為了使樹突狀細胞疫苗能更準確的在患者腫瘤部位發生效力，通過研究發現標靶腫瘤瘤體內高表達蛋白是一種可靠的方法。HARDWICK 等［30］發現頭頸部鱗癌患者腫瘤細胞中存在P53 肽的蓄積，該試驗使用P53 蛋白標靶樹突狀疫苗，證實了被標靶的疫苗可在體內有效地遷移。由此設計的Ⅰ期臨床實驗，在16 例患者中有11 例（69%）患者接種P53 肽標靶的疫苗后，體內特異性T 細胞的數量和IFN-g 的分泌量增加以及調節性T 細胞（Treg）的水平持續下降，而調節性T 細胞通常被認為可能會阻斷抗腫瘤反應。但是該實驗的樣本量很少，需要開展大樣本量的Ⅱ-Ⅳ期隨機臨床實驗，尋找腫瘤周圍異常蓄積的肽或其他可以穩定結合的基團，可能會使得疫苗更有效地遷移。腫瘤靶點的研究依舊是當下抗腫瘤藥物研究的熱點話題，表皮生長因子受體的過表達在頭頸部鱗狀細胞癌以及其他系統腫瘤中很常見。利用重組純化谷胱甘肽-S-轉移酶（GST）-EGFR 融合蛋白［31］，脈沖處理小鼠的樹突狀細胞制備成疫苗，并評估該種方法制備的疫苗引起的細胞毒性T 淋巴細胞反應、干擾素分泌水平、腫瘤生長速度和小鼠存活率等，相比對照組，實驗組接種GST-EGFR融合蛋白脈沖DC疫苗的小鼠在體外和體內均顯示出了明顯的抗腫瘤效應（P＜0.05）。有研究指出卵泡抑素樣蛋白-1（FSTL-1）在許多腫瘤中可觀測其過高或過低表達，FSTL-1 可通過改變核因子kb 和Jun-N 末端激酶的表達從而提高鼻咽癌患者樹突狀細胞的免疫效力［32］，但需要相關研究證實OSCC患者中該蛋白的表達水平或相關信號通路及調控環節。

5 小結與展望

提高樹突狀細胞疫苗有效遷移能力的同時仍需提高樹突狀細胞本身的免疫能力，二者結合可能會提高樹突狀細胞疫苗的效力，逆轉其在體內免疫抑制的狀態。目前學術研究在了解基因組和免疫關系方面取得了一些進展，但迄今為止臨床上有用的生物標記物很少，并且需要系統評估腫瘤細胞的異質性、免疫微環境的變化以及宿主的個體因素［33］，對疫苗的改進帶來巨大的挑戰。很多免疫、腫瘤學家將腫瘤的免疫治療視為“失敗的假設”，對免疫系統和網狀樹突狀細胞系統認知不夠全面系統深入依舊是當前主要問題。如能發現更有效的免疫因子佐劑來提高樹突狀細胞的攝取處理遞呈抗原能力，或刺激分泌下游的免疫因子，從而調控整個免疫應答過程；找尋并標靶更有效生物標記物，或篩選基因片段重組質粒轉染樹突狀細胞，從而改變疫苗遷移的生物行為；使用外泌體作為疫苗的載體并聯合使用免疫檢查點抑制劑等，為改進疫苗提供了不同的視角。隨著人們對免疫系統的深入認識以及對樹突狀細胞亞群特性方面的掌握，相信未來樹突狀細胞疫苗會在口腔腫瘤的臨床治療中更為廣泛地受到應用并為患者帶來新的希望。