ACACB基因DNA甲基化/過表達的肝癌細胞株MHCC97H增殖侵襲遷移能力變化觀察

伍柳玉，胡艷玲，劉順，秦小玲，梁秋麗，劉美良，楊鈺，曾小云

1廣西醫科大學公共衛生學院，南寧530199；2廣西醫科大學生命科學研究院；3廣西中醫藥大學公共與管理學院

研究［1-2］顯示，乙酰輔酶A羧化酶（ACACB）作為參與體內氧化應激、脂質代謝等過程的關鍵基因，被發現在癌癥中也發揮重要作用。已有研究［3-4］顯示，ACACB基因在肝細胞癌（HCC）組織中存在表達下調現象，可能與肝癌的發生發展有關。DNA甲基化作為表觀遺傳的一種，被認為是腫瘤發生的重要危險因素。研究［5-6］表明，在各腫瘤細胞中普遍存在DNA的異常甲基化，其存在導致相關基因表達的沉默或上調，造成包括DNA修復、細胞周期調節、促進細胞凋亡或控制關鍵的腫瘤相關信號網絡通路的改變，影響腫瘤的診斷、發展、分型以及治療敏感性［7-8］。本課題組前期通過TCGA數據庫對ACACB基因進行生物信息學整合時發現，ACACB在肝癌組織中表達下調，且與其甲基化位點cg06131338的甲基化水平呈負相關，據此推測ACACB基因可能具有影響肝癌發生發展的作用，但進一步的研究論證尚未在肝癌細胞株中開展。2018年10月—2020年1月，本研究觀察了抑制ACACB基因DNA甲基化/感染ACACB基因過表達慢病毒dCAS9-VP64的肝癌細胞株MHCC97H增殖侵襲遷移能力變化情況，現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞株、試劑 肝癌細胞株SMMC7721、Hep3B、MHCC97H、MHCC97L及正常肝細胞株LO2均購買于上海中國科學院細胞庫，使用含有10%胎牛血清的培養基，于37℃、5%CO2飽和濕度的細胞培養箱中進行細胞培養，待細胞密度達80%～90%時進行傳代及細胞提取。胎牛血清、DMEM/MEM/RPMI1640細胞培養基購自美國Gibco公司，胰蛋白酶-EDTA消化液、PBS緩沖液、二甲基亞砜(DMSO）購自北京索萊寶公司，氯仿購自北京天根公司，TRIzol購自美國Life公司，Thermo Scientific Gene-JET基因組DNA純化試劑盒購自Thermo公司，DNA maker購自北京天根公司，CCK8試劑購自日本同仁化學公司，反轉錄試劑盒、PCR試劑盒購自Ta-KaRa公司，DNA甲基化轉移酶抑制劑5-氮雜脫氧胞苷（5-Aza-CdR）購自美國Sigma公司，引物由生工生物公司合成，ACACB過表達慢病毒dCAS9-VP64購自上海吉凱基因公司。

1.2 SMMC7721、Hep3B、MHCC97H、MHCC97L及LO2中ACACB mRNA檢測 取SMMC7721、Hep3B、MHCC97H、MHCC97L及LO2細胞于培養板中，使用Thermo Scientific GeneJET基因組DNA純化試劑盒提取總DNA，使用TRIzol試劑裂解細胞并提取RNA，使用Bio-teck酶標儀進行濃度及純度的檢測。使用PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒將RNA逆轉錄成cDNA，以cDNA為模板，按照TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ說明進行PCR擴增。ACACB上游引物為5′-GGGAAAGCAAAATGAATGGAAG-3′，下游引物為5′-GAGAAGAGGTGGGCAGAGGA-3′；內參GAPDH上游引物為5′-AGCCACATCGCTCAGACAC-3′，下游引物為5′-GCCCAATACGACCAAATCC-3′。PCR擴增體系共20μL：TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ10μL，cDNA模板2μL，ROX Reference Dye 0.4μL，上下游引物各0.8μL，dH2O 6μL。PCR反應條件：95℃30 s，95℃5 s，60℃30 s，40個循環，以2-ΔΔCt表示細胞中ACACB mRNA的相對表達量。

1.3 SMMC7721、Hep3B、MHCC97H、MHCC97L、LO2細胞中ACACB基因cg06131338位點甲基化率測算及受試肝癌細胞株篩選 采用焦磷酸測序實驗，取SMMC7721、Hep3B、MHCC97H、MHCC97L及LO2細胞于培養板中，使用Thermo Scientific Gene-JET基因組DNA純化試劑盒提取總DNA，使用Bioteck酶標儀進行濃度及純度的檢測。重亞硫酸氫鹽的轉化按照EpiTect Plus DNA Bisulfite Kit 59124試劑盒的說明進行，配置的亞硫酸鹽轉化體系為140μL：DNA溶液40μL，亞硫酸氫鹽混合液85μL，DNA Protect Buffer 15μL，RNase-free water補充至總體積140μL，熱循環條件：95℃5 min，60℃25 min，95℃5 min，60℃85 min，95℃5 min，60℃175 min。ACACB基因cg06131338位點的上游引物為F-TGGAGTTATATATAGGGTGGATTTTAGAAG，下 游 引物為R-CAATCCCCATAAACTCTATACTATTTCTTC。甲基化PCR反應 體系：dH2O 34.8μL，5×buffer 10μL，dNTP 1μL，上下游引物各1μL，Template 2μL，Taq 0.2μL。反應條件：95℃3 min，94℃30 s，54℃30 s，72℃1 min，72℃7 min，40個循環。甲基化的檢測通過Pyrosequencing檢測儀進行，反應結束后使用PyroMark Q96 ID軟件自動計算每個CpG位點的甲基化率。

1.4 受試肝癌細胞株ACACB基因DNA甲基化的抑制及分組 選取甲基化率相對較高的肝癌細胞株MHCC97H，調整細胞懸液濃度至3.5×104/mL，按每孔2 mL的體積接種于6孔板中，正常培養16～24 h后分為5-Aza-CdR組、對照組。5-Aza-CdR組每孔加入2 mL濃度為2.5μmol/L的5-Aza-CdR完全培養基，對照組加入含相同劑量DMSO完全培養基，每隔24 h更換一次完全培養基，持續培養96 h后收集細胞，參照“1.3”測算5-Aza-CdR組、對照組細胞中ACACB基因cg06131338位點甲基化率，參照“1.2”檢測5-Aza-CdR組、對照組細胞中ACACB mRNA。

1.5 受試肝癌細胞株ACACB基因過表達慢病毒dCAS9-VP64感染及分組 采用SAM雙載體慢病毒感染法。選取甲基化率相對較高的肝癌細胞株，取8×104個細胞接種于6孔板中，培養16～24 h后，感染dCAS9-VP64-Puro慢病毒并繼續培養12 h，更換為正常培養基，3 d后改用2.5μmol/L嘌呤霉素濃度的完全培養基進行篩選。收集成功感染dCAS9-VP64-Puro慢病毒的細胞分為ACACB過表達組和陰性表達組，按照上述步驟感染dCAS9-VP64慢病毒和陰性對照慢病毒，參照“1.2”檢測ACACB過表達組、陰性對照組細胞中ACACB mRNA。

1.6 各組細胞增殖能力觀察 取各組細胞以1 000/孔的量接種于96孔板中，每組重復6個平行復孔，培養8 h待細胞貼壁后，將完全培養基與CCK8試劑按9∶1的比例混合，以100μL/孔的混合液加入后，在培養箱中繼續孵育72 h，在450 nm波長下使用酶標儀讀取每孔的OD值，以OD值表示細胞增殖能力。

1.7 各組細胞侵襲、遷移能力觀察 ①各組細胞侵襲能力觀察。取各組細胞，以1×105個加入含有基質膠的侵襲小室的上層，小室下層加入650μL的完全培養基，培養箱中繼續培養72 h后，使用4%多聚甲醛固定下表面的穿膜細胞，用0.1%的結晶紫染色、干燥，各侵襲小室在顯微鏡下隨機選取6個視野的細胞進行計數，以侵襲細胞數表示細胞增殖能力。②細胞遷移能力觀察。取各組細胞，以5×104個加入不含基質膠的遷移小室的上層，小室下層加入650μL的完全培養基，培養箱中繼續培養72 h后，使用4%多聚甲醛固定下表面的穿膜細胞，用0.1%的結晶紫染色、干燥，顯微鏡下隨機選取6個視野的細胞進行計數，以遷移細胞數表示細胞遷移能力。

1.8 統計學方法 采用SPSS22.0統計軟件。計量資料以±s表示，比較用兩獨立樣本t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SMMC7721、Hep3B、MHCC97H、MHCC97L及LO2中ACACB mRNA相對表達量比較 SMMC7721、Hep3B、MHCC97H、MHCC97L中ACACB mRNA的相對表達量分別為0.54±0.04、0.48±0.05、0.39±0.03、0.34±0.01，LO2中ACACB mRNA的相對表達量為1.04±0.07，SMMC7721、Hep3B、MHCC97H、MHCC97L中ACACB mRNA的相對表達量與LO2相比，P均<0.01。

2.2 SMMC7721、Hep3B、MHCC97H、MHCC97L、LO2細胞中ACACB基因cg06131338位點甲基化率比較及受試肝癌細胞株篩選結果 肝癌細胞株SMMC7721、Hep3B、MHCC97H、MHCC97L中ACACB基因cg06131338位點甲基化率分別為54.68%±3.63%、62.43%±3.77%、66.29%±2.29%、62.25%±3.28%，正常肝細胞株LO2中ACACB基因cg06131338位點甲基化率為44.29%±3.69%，肝癌細胞株SMMC7721、Hep3B、MHCC97H、MHCC97L中ACACB基因cg06131338位點甲基化率與正常肝細胞株LO2相比，P均<0.01。其中，cg06131338位點甲基化率相對較高的肝癌細胞株為MHCC97H，選取MHCC97H為后續實驗受試肝癌細胞株。

2.3 5-Aza-CdR組和對照組細胞中ACACB基因cg06131338位點甲基化率、ACACB mRNA相對表達量比較 5-Aza-CdR組和對照組細胞中ACACB基因cg06131338位點甲基化率分別為45.59%±2.51%、67.55%±3.18%，兩組相比，P<0.01。5-Aza-CdR組和對照組細胞中ACACB mRNA相對表達量分別為0.52±0.03、0.39±0.03，兩組相比，P<0.01。

2.4 ACACB過表達組、陰性對照組細胞中ACACB mRNA相對表達量比較 ACACB過表達組、陰性對照組細胞中ACACB mRNA的相對表達量分別為5.90±0.65、1.04±0.05，兩組相比，P<0.01。

2.5 各組細胞增殖能力比較 5-Aza-CdR組和對照組細胞孵育72 h時的OD值分別為0.42±0.01、0.58±0.01，兩組相比，P<0.05。ACACB過表達組和陰性對照組細胞孵育72 h時的OD值分別為0.37±0.04、0.45±0.05，兩組相比，P<0.05。

2.6 各組細胞侵襲、遷移能力比較 5-Aza-CdR組和對照組侵襲細胞數分別為（12±4）、（43±3）個，兩組相比，P<0.01。ACACB過表達組和陰性對照組侵襲細胞數分別為（17±5）、（47±7）個，兩組相比，P<0.01。5-Aza-CdR組和對照組遷移細胞數分別為（21±4）、（63±6）個，兩組相比，P<0.01。ACACB過表達組和陰性對照組遷移細胞數分別為（17±6）、（49±14）個，兩組相比，P<0.01。

3 討論

HCC是全球范圍內最常見的幾大癌癥之一。研究［9］顯示，HCC是一種復雜的、多步驟的疾病，涉及的過程與基因組的擴增、缺失或突變有關。同時，由于HCC起病隱匿、病死率高［10］，因此尋找高靈敏度與高特異度的肝癌早期診斷分子生物標記物仍是當前研究的重點。

ACACB基因是催化脂肪酸合成代謝第一步反應的限速酶［11］，可能參與多種腫瘤的形成與發展，其表達能對相關癌癥的走向產生影響。早期針對視網膜母細胞瘤的研究［12］顯示，ACACB基因可能通過參與有關細胞信號通路的調控，如脂質的代謝、氧化應激、細胞周期與細胞凋亡等，從而在視網膜母細胞瘤的進展中發揮重要作用。還有研究［13］發現，ACACB基因與肺癌患者的生存率顯著相關，并且在人肺癌樣本中表達普遍下調，且通過建立小鼠基因敲除模型，驗證了ACACB基因的敲除能顯著促進小鼠體內肺腫瘤的發生。本研究通過LO2肝細胞株與4株肝癌細胞株SMMC7721、Hep3B、MHCC97H、MHCC97的培養與檢測，發現了ACACB基因在肝癌細胞株中表達明顯降低，進一步，我們通過在MHCC97H細胞株中過表達ACACB基因后，發現細胞的增殖、侵襲與遷移的能力均下降，故推測ACACB基因在HCC的惡性化進展中可能發揮抑癌基因的作用。相關體內研究［13-14］亦顯示ACACB基因在腫瘤抑制中的作用，這與本研究結果具有一致性。

DNA甲基化作為最常見的一種表觀遺傳方式，對細胞的分化與功能起著至關重要的作用［15］。隨著基因組學研究的深入，發現表觀遺傳學、基因表達、腫瘤發生三者之間密切相關。研究［5-6］表明，當基因組特定序列出現異常的高/低甲基化時，往往能導致相關基因表達的改變，影響腫瘤的發生發展。QI等［16］通過大樣本人群驗證了MGMT基因的超甲基化與大腸癌中MGMT表達的缺失有關，認為MGMT基因表觀遺傳失活加快了大腸癌的進程。SIZEMORE等［17］通過建立乳腺癌患者隊列研究發現，基因MMP7的表達與其啟動子甲基化狀態顯著相關。不僅如此，由于異常甲基化的發生通常要先于細胞的惡性增生，故而DNA的局部異常甲基化對腫瘤發生風險的預測及早期癌癥篩查方面具有重要參考作用［18］。本研究中，通過檢測ACACB基因cg06131338位點在LO2肝細胞株與肝癌細胞株SMMC7721、Hep3B、MHCC97H、MHCC97L中的甲基化水平，發現了cg06131338位點在各肝癌細胞株中甲基化率顯著增加，且可能與基因表達的抑制有關。為進一步探索，我們利用DNA甲基化可逆的特點，使用甲基轉移酶抑制劑5-Aza-CdR作用于MHCC97H細胞，發現在cg06131338位點的甲基化水平降低的同時，ACACB的轉錄水平也相應升高。隨后，本研究通過細胞相關功能實驗發現，5-Aza-CdR的處理能顯著抑制細胞的增殖、侵襲與遷移的能力。本研究結果表明，cg06131338位點的高甲基化可能通過抑制基因ACACB的表達，并由此促進HCC的進展。

綜上，在肝癌細胞株SMMC7721、Hep3B、MHCC97H、MHCC97L中，ACACB mRNA表達降低、ACACB基因cg06131338位點甲基化率升高，抑制cg06131338位點的甲基化可升高ACACB mRNA表達水平。抑制cg06131338位點的甲基化或過表達ACACB均可降低MHCC97H細胞增殖、侵襲和遷移能力。ACACB基因可能是HCC中潛在的抑癌基因，ACACB基因及其甲基化位點cg06131338可能是潛在的肝癌早期診斷標記物與治療靶點。