外泌體分離、表征方法及其在環境毒理學中的應用研究進展

董平軒，崔淑芹，楊朝，尹文英，朱俊宇，童明瓊

德州學院醫藥與護理學院，山東德州253023

1983年，JOHNSTONE等［1］在綿羊網織紅細胞上清液中首次發現囊泡狀結構，并將其命名為exosome，即外泌體［2］。外泌體是一類由細胞分泌的直徑30～150 nm脂質雙分子層囊泡，膜內含有蛋白質、脂類、mRNA、miRNA和代謝物等［3］。外泌體密度介于1.13～1.21 g/cm3，最早形成于細胞胞吞形成的早期內體，早期內體再內凹形成管腔內囊泡，管腔內囊泡進一步形成多泡小體，多泡小體與細胞膜融合被分泌出去，形成外泌體［3-4］。幾乎所有細胞都能產生外泌體，外泌體可從各種體液和腫瘤等實體組織中分離出來［4］。研究［4］顯示，外泌體參與免疫反應、病毒感染、心腦血管疾病和癌癥等生理病理過程。VALADI等［5］發現，鼠肥大細胞分泌外泌體將其攜帶的mRNA傳遞給人肥大細胞，并翻譯成蛋白質。外泌體還通過其攜帶的mi RNA調節靶細胞mRNA水平。研究［6］發現，外泌體通過其攜帶的調節神經回路發育信號分子，使受疾病影響的腦細胞恢復正常。近期研究［7］顯示，來自新冠病毒肺炎（COVID-19）重癥患者肺細胞外泌體參與了病毒侵染和免疫逃逸過程。外泌體成分反映了供體細胞的狀態，因此分析外泌體可實現對癌癥等疾病的早期診斷［4］。外泌體還因其毒性低、無免疫原性和滲透力好等優勢，在miRNA、抗體和化療藥物等藥物遞送中具有巨大應用潛力［4］。在環境污染物的毒性和機理研究中，外泌體及其內含物也被作為生物標志物或用于闡釋致病機理的模型。因此，需要開發簡單、快速、高通量且不破壞外泌體結構的分離方法和更準確的表征方法，有利于其后期功能研究和應用。本研究就外泌體分離和表征方法及其在環境毒理學中的應用進展進行了綜述，以期為探索外泌體環境污染物毒性及其毒性機制研究領域的潛在應用提供思路。

1 外泌體的分離方法

依據外泌體密度、大小和所含標志蛋白等特性，產生了不同的外泌體分離方法，包括超速離心法、聚合物沉淀法、免疫捕獲法、尺寸排阻色譜法、超濾法和微流控技術法等［8］。外泌體的分離存在許多難點，一是外泌體來源的異質性和復雜性；二是方法的可擴展性和通量，如臨床治療用的外泌體需要符合GMP標準的大規模外泌體的提取方法［9］；三是樣品收集、處理和保存的指導原則/標準的建立，以保障研究的可重復性和臨床應用［8］。開發回收率高、高特異性和高通量的分離方法是外泌體分離的未來發展趨勢。

1.1 超速離心法 超速離心又稱為差速離心，是一種基于外泌體的密度和尺寸的分離方法，最高離心力通常選擇100 000～120 000×g。JOHNSTONE早期分離外泌體也是采用此法。THERY等［9］對從細胞上清、尿液、血清及腹水等體液中差速離心分離外泌體進行了總結。先經300×g、2 000×g、10 000×g低速和高速離心去除細胞、死細胞和細胞碎片，再經4℃超高速100 000～120 000×g離心，獲得沉淀，PBS重懸后，再次超高速100 000×g離心沉降外泌體以去除雜蛋白。此方法比較成熟，處理較大容量的樣本，應用范圍廣，因此成為使用頻率最高的一種分離方法［11］。但也存在外泌體純度不高，需要投入昂貴的設備等缺點。超速離心得到的樣品可通過密度梯度離心提高分離外泌體的純度［12］。密度梯度離心的介質主要是蔗糖、碘海醇和碘克沙醇等［10］。密度梯度離心法操作復雜，對操作者技術要求較高、通量不高、耗時較長，且不易去除血液樣本的脂蛋白和乳糜微粒［8］。

1.2 聚合物沉淀法 聚合物沉淀法依據聚合物降低外泌體的溶解性易于沉淀來純化外泌體，可以提取血液、腦髓液、尿液、細胞培養上清等樣本的外泌體，通常使用聚乙二醇（PEG）。許多商品化試劑盒是基于聚合物沉淀原理分離外泌體。用Invitrogen、101Bin和Wako等試劑盒和傳統的超速離心法提取外泌體，結果顯示不同試劑盒分離外泌體的產率不同［13］。鄭程峰等［14］用試劑盒分離人牙髓細胞外泌體的產率比差速離心法高，但含有雜質。聚合物沉淀法有簡單、快速且無需使用昂貴設備等優點。但商品化試劑盒價格昂貴，純化過程中易受到聚合物污染影響后續實驗［8］。

1.3 免疫捕獲法 CD63、CD9、CD81和ALIX等外泌體表面的膜蛋白可與相應抗體產生特異性免疫結合反應，實現外泌體的提取。商業化試劑盒（Exo-Flow）基于此分離外泌體［8］。NAKAI等［15］利用小鼠T淋巴細胞膜蛋白（Tim4）和外泌體表面磷脂酰絲氨酸的特異性結合分離純化外泌體。免疫捕獲法有特異性強、能有效減少蛋白質等干擾物的優點，缺點是抗體成本高，通量小等。SAMSONOV等［16］利用凝集素對外泌體膜上糖類殘基高親和力的特性，從尿液中分離出了外泌體。根據肝素非特異性結合多種蛋白的性質，BALAJ等［17］從細胞培養上清和人血漿中提取出了外泌體。這在一定程度上降低了費用，但含有較多雜質。

1.4 尺寸排斥色譜法 尺寸排斥色譜又稱空間排阻色譜，是根據分子或顆粒物的尺寸大小進行外泌體分離的一種方法。AN等［18］使用尺寸排斥色譜、超速離心法、先超速離心后用尺寸排斥色譜三種方法分離人血清外泌體，結果顯示，尺寸排斥色譜提取的外泌體蛋白和血清蛋白含量更高，先超速離心后用尺寸排斥色譜提取外泌體可去除血清蛋白。尺寸排斥色譜的優勢是操作簡單、重現性好，處理樣本量大且分離的外泌體大小比較均勻［19］，其缺點是處理樣本時會稀釋其濃度，色譜柱不能重復使用，且費用較高。

1.5 超濾法 不同孔徑（0.22μm、0.45μm和0.8μm）超濾膜可以分離不同大小的胞外囊泡和外泌體。超濾法可結合差速離心分離外泌體，樣品先經0.45μm濾膜去除細胞和細胞碎片，低溫超速離心獲取沉淀，PBS重懸后再次離心，再經0.22μm濾膜除菌得到高純度外泌體。超濾法提取外泌體具有簡單、快速和高效的特點，缺點是膜的粘附性降低外泌體的產量，過濾時壓力和剪切力會使外泌體變形受損，且濾膜容易破損或堵塞影響分離效果［8］。

1.6 微流控技術法 微流控技術是一種新興的微尺度分離技術，是在微流控技術的基礎上結合聲波、介電電泳或微流體黏性等特性發展起來的，可利用外泌體的大小、密度和黏滯彈性等參數的差異對其進行分離［20］。此法分離的外泌體具有所需樣本小、檢測速度快及檢測成本低等優點，但是處理的樣本量小、通量低且樣品處理復雜。

2 外泌體的表征方法

目前有關外泌體表征方法的研究較多，目前研究的熱點：一是外泌體表征方法的標準化，二是對來源受限珍貴樣本（比如手指血、新生兒樣本、淚液樣本等）需開發高靈敏、信息化多元的定量方法，三是建立特異性、高通量和完整外泌體表征方法以促進外泌體的研究和臨床應用［8］。目前可通過電子顯微鏡、動態光散射、納米粒子追蹤分析、流式細胞儀等對外泌體的物理形貌和尺寸大小特征進行直觀表征或定量分析，對于其組分如RNA、蛋白質和脂類分子等生化特征，則用紫外吸收、電泳、qRT-PCR、蛋白質免疫印跡、酶聯免疫吸附、蛋白質組學和脂類組學等方法進行定量表征。

2.1 電子顯微鏡和成像技術表征法 高分辨率的電子顯微鏡成像是觀察外泌體形貌最常用的選擇。其中，透射電鏡比掃描電鏡使用頻率高。由于對電鏡圖像中單個囊泡手動分析比較費時，KOTRBOVá等［21］開發了一種半自動軟件工具，它可以分析比周圍環境更暗的囊泡，并將囊泡與電鏡圖像中的沉淀染色、蛋白質聚集體和其他雜質區分出來，但仍無法區分細胞外囊泡和脂蛋白顆粒。透射電鏡不提供外泌體濃度信息且觀察視野受限制。SOKOLOVA等［22］用掃描電鏡觀察人胚胎腎細胞系和骨髓間充質干細胞分離得到的外泌體。冷凍電鏡可以在冷凍條件下通過電子顯微成像清晰直接地展示出外泌體尺寸、形態和結構，且無脫水和染色步驟，對樣本破壞性小。原子力顯微鏡通過抗CD41抗體功能化硅表面捕獲含有CD41分子的胞外囊泡，檢測其數量和粒徑分布，其分辨率可以達到幾納米，比常規的流式的分辨率更靈敏。各種電鏡均需要貴重的儀器、成本較高且通量較小。

2.2 動態光散射和納米粒子追蹤分析表征法 動態光散射是基于光譜學測定液體基質中懸浮顆粒物粒徑分布的方法。動態光散射應用在蛋白質、外泌體等的粒徑分析上具有簡單、快速、重復性好的優點。但在測量時，小顆粒的光強度波動信號會被大的顆粒遮蓋，所以不適合大小不均勻的異質性/多分散性樣本［12］。納米粒子追蹤分析與動態光散射相似，檢測囊泡粒徑分布的同時也能檢測顆粒物濃度［22］，其優點是不破壞外泌體的結構、檢測速度快且樣本制備簡單等，缺點是無法區分蛋白顆粒和囊泡，檢測到的濃度偏高。

2.3 流式細胞術表征法 流式細胞術用于表征外泌體表面標志蛋白、囊泡大小和數量分布等，也可通過熒光標記示蹤外泌體［12］。特異性蛋白染料熒光標記后，不需要離心除去未結合的染料，直接通過流式檢測結合熒光標記的囊泡。傳統的流式細胞儀分析>200 nm顆粒時難以準確測量外泌體，研究者開發出納米流式細胞儀，使用熒光探針的高熒光觸發流式細胞儀可以檢測外泌體和其它細胞外囊泡的大小和分布。流式細胞術檢測用量少、快速，兼具高通量和特異性定量分析的優點，缺點是需要特殊設備，且尺寸計算有誤差。

2.4 蛋白質免疫印跡和酶聯免疫吸附定量分析表征法 利用紫外可見分光光度法、BCA和電泳對外泌體總蛋白質和RNA含量進行定量。蛋白質免疫印跡和酶聯免疫吸附常用于外泌體表面標志蛋白鑒定和定量。常用的外泌體的標志蛋白是跨膜蛋白CD9、CD63、CD81和TSG101、ALIX等多泡小體發生蛋白［4］。ELISA的優勢是靈敏度高、特異性強、時間短（4 h）、通量高（96孔板），但抗原需要兩個或兩個以上的抗原表位。Western blot法特異性高，可以同時檢測蛋白的分子大小和豐度，但操作繁瑣，耗時長（>10 h）。兩種方法都依賴抗體，都存在交叉反應性的問題［8］。

2.5 微陣列和基于質譜的組學技術表征法 微陣列（即芯片技術）可用于研究外泌體DNA/RNA在毒理學和疾病的分子機制研究中的作用。其優點是通量高，可同時檢測上萬條RNA或DNA片段，缺點是價格昂貴，需要qRT-PCR實驗驗證或結合測序技術（NGS/RNA-seq）發現新的有功能RNA/miRNA序列。近年來，基于液相色譜-質譜/質譜連用（LCMS/MS）的組學分析逐漸廣泛應用于分析外泌體的蛋白質組和脂質組，可用于特定蛋白質、糖蛋白和脂蛋白的確認與定量，并進一步研究外泌體攜帶貨物分選、疾病和毒理標志物篩選等。

3 外泌體在環境毒理學中的應用

3.1 外泌體作為環境毒理學的生物標志物 化學品的暴露會改變外泌體的分泌及其成分，進而影響細胞周圍的微環境的改變。BALA等［23］發現在酒精導致酒精肝動物模型中血清外泌體的miR155增加，藥物誘發的肝損傷則會明顯增加miR122的含量。ZHOU等［24］發現尿液外泌體胎球蛋白A的含量在急性腎損傷的動物模型和患者中都顯著上升，在不同類型腎損傷尿液外泌體中不同轉錄因子表達存在差異。LV等［25］發現腎纖維化患者尿液外泌體miR29明顯高于對照組。KULKARNI等［26］發現高劑量離子輻射暴露動物后血清和尿液外泌體呈現不同的生物標志物。因此，外泌體及其內含mi RNA/蛋白可作為化學品或藥物導致相關疾病的毒理標志物。

3.2 外泌體為環境污染物暴露相關疾病的毒性機制提供模型 環境污染物如重金屬、殺蟲劑和有機溶劑等的暴露導致神經系統等相關疾病過程中，外泌體及其內含物可能參與這些疾病進程，為進一步揭示環境毒理機制提供依據。HARISCHANDRA等［27］發現錳的暴露促進培養神經細胞分泌外泌體，其中miRNA含量增加調控Tau蛋白聚集、自噬、炎癥等過程，進而加快錳導致的帕金森病進程。FUJITA等［28］發現香煙煙氣暴露的支氣管上皮細胞產生的外泌體中miR-210，可在體外促進成纖維細胞的增殖分化。這些研究表明外泌體在香煙煙氣導致纖維化和慢性阻塞性肺氣的發病機制發揮重要作用。MUNSON等［29］發現石棉暴露肺上皮細胞和巨噬細胞分泌的外泌體可誘導間皮細胞癌變。重金屬砷中毒患者血清外泌體miR155含量增加，導致正常干細胞的炎癥反應，而過度炎癥反應被認為是為細胞癌變提供微環境。LIM等［30］發現，室內污染物甲苯暴露早幼粒細胞白血病細胞，導致其外泌體多個miRNA異常表達，這些miRNA靶基因與癌癥、神經系統、心血管和呼吸系統疾病相關。因此，外泌體及內含miRNA可為闡釋環境污染物誘發疾病的機制提供依據。

綜上所述，外泌體在生理、病理、毒理和臨床治療中發揮重要作用。目前已有多種外泌體分離和表征方法，但不能滿足研究和臨床需求，因此，需要開發簡單、快速、高通量且不破壞外泌體結構的分離方法和更準確的表征方法，有利于其后期功能研究和應用。外泌體及內含生物分子可作為環境毒理學的生物標志物，可為今后研究環境污染物的毒性作用和機制研究提供模型。