糖尿病與糖尿病并發肺結核患者的血漿代謝組學對比研究

王美杰 李雨澤 肖瑤 吳明歧 侯紹英

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是繼艾滋病后，誘發肺結核(pulmonary tuberculosis，PTB)的另一重要危險因素[1]。DM不但能使PTB的發病率增加3倍，而且還會降低其治療效果[2-3]。DM并發PTB(DM-PTB)的原因是多方面的，現有研究多集中于免疫、遺傳等方面[4-5]，雖然為DM患者高并發PTB的原因提供了一定的分子機制，但仍不足以完全解釋其高發原因[6]。代謝組學通過對生物樣本的檢測，可全面考察生物體受刺激后其內源性代謝物的變化，已經成為生命科學領域的重要研究手段。因此，本研究旨在進行基于超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜(ultra high performance liquid chromatography tandem quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UPLC-Q-TOF MS)技術的代謝組學研究，描述DM-PTB患者的血漿代謝組學特征，為其機制研究提供新思路。

資料和方法

1.研究對象：搜集2017年1—6月在黑龍江省傳染病防治院確診的DM患者(DM組)和DM-PTB患者(DM-PTB組)，對兩組研究對象根據年齡、性別、血糖、DM病程等進行匹配，最終每組各納入10例患者，收集患者的基本信息。所有研究對象均為漢族，且簽署知情同意書。采用加乙二胺四乙酸(EDTA)的抗凝管收集研究對象清晨空腹靜脈血10 ml，3000×g離心10 min后，收集上清液，分裝后于-80 ℃保存。

2.納入標準：(1)DM組：按照 2010 年美國糖尿病協會糖尿病診斷標準進行確診[7]。(2)DM-PTB組：對DM患者進行檢查，參照《WS 288—2017 肺結核診斷》[8]標準，根據咳嗽、發熱等臨床癥狀，結合痰涂片和胸部 X 線攝影等檢查確診并發肺結核。

3.排除標準：肝硬變、腫瘤、肺炎、肺癌等疾病患者；HIV感染、乙型病毒性肝炎等傳染病患者；孕婦或哺乳期女性及服用免疫抑制劑者；既往服用過抗結核藥品者。

4.儀器及試劑：Acquity UPLC 超高效液相色譜儀(美國Waters公司)，XEVO G2-XSQ-TOF質譜儀(美國Waters公司)，UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm， 1.7 μm，美國Waters公司)。乙腈、甲醇、甲酸(色譜級，美國Fisher Scientific 公司)，亮氨酸腦啡肽(美國Sigma公司)。

5.樣品前處理：血漿樣品于冰上解凍后，吸取100 μl血漿于EP管，加入200 μl冰甲醇，渦旋混勻后靜置15 min沉淀蛋白，于4 ℃條件下12 000×g離心15 min，收集上清液并用氮氣吹干。用乙腈水溶液(乙腈∶水=1∶2)充分復溶后，12 000×g離心15 min，收集上清液350 μl上機檢測。同時等量混合所有血漿樣品，制備質量控制(quality control，QC)樣品。本實驗采取隨機進樣，每隔10個樣品采集1次QC，以便進行質量控制。

6.色譜條件：應用UPLC BEH C18色譜柱進行血漿樣品的色譜分離。柱溫35 ℃，流率為0.45 ml/min。自動進樣室溫度為4 ℃，進樣量為4 μl。流動相A：0.1%甲酸；流動相B：乙腈。樣品梯度洗脫程序：0～0.5 min，2%乙腈；0.5～5.5 min，2%～70%乙腈；5.5～9.0 min，70%乙腈；9～11 min，70%～98%乙腈；11～12.5 min，98%乙腈；12～14 min，98%～2%乙腈；14～16 min，2%乙腈。

7.質譜條件：采用電噴霧離子源(electrospray ionization，ESI)在負離子模式下采集質譜信息。亮氨酸-腦啡肽為調諧液，進行儀器的實時矯正。質譜數據在MSE模式下獲得，質量掃描范圍50～1200 m/z，毛細管電壓為0.5 kV，錐孔電壓為60 V，離子源溫度為110 ℃，脫溶劑氣溫度為450 ℃，錐孔氣流流率為50 L/h，脫溶劑氣流流率為900 L/h。

結 果

1.基本情況：DM組和DM-PTB組患者年齡、性別、DM病程、血糖、甘油三酯比較，差異均無統計學意義，總膽固醇組間比較差異有統計學意義，見表1。

2.血漿代謝圖譜差異分析：負離子模式下兩組患者樣本基峰強度色譜圖中可以看出兩組離子強度基本相同，但兩組樣本血漿代謝圖譜存在明顯差異，說明DM和DM-PTB患者存在代謝差異(圖1)。

3.代謝組學數據可靠性驗證：通過PCA得分圖(圖2)顯示，QC樣本緊密聚合，集中聚集在樣本中間，表明在檢測過程中儀器運行穩定，數據真實、可靠。

表1 兩組研究對象的基本情況比較

圖中數值為色譜峰的保留時間(min)

圖2 質量控制樣本與實驗樣本主成分分析得分圖

4.DM和DM-PTB患者差異代謝產物分析：對DM組和DM-PTB組患者血漿代謝數據分別進行PCA分析、OPLS-DA分析，結果如圖3～5所示。PCA分析(圖3)顯示所有樣本均分布在95%置信區間內，兩組具有一定的分離趨勢。為了減少組內個體差異對結果的影響，進一步采用有監督的OPLS-DA模型對兩組差異代謝物進行分析，結果顯示(圖4)兩組完全分離，且所有樣本均分布在95%置信區間內，模型具有較好的解釋性和預測力(R2=0.94，Q2=0.75)。對OPLS-DA模型做200次隨機置換檢驗(圖5)，預測值均小于原始值，表明模型沒有過擬合，該模型穩健、可靠。通過以上分析，表明DM組和DM-PTB組患者的代謝物存在明顯差異。

5.DM和DM-PTB患者血漿差異代謝產物的篩選：以VIP>1、t檢驗(P<0.05)和差異倍數>1.5作為標準，篩選潛在差異代謝產物。本研究初步鑒定了7個候選代謝物，見表2。其中，與DM組比較，DM-PTB組血漿6-酮-前列腺素F1a、原卟啉原Ⅸ、亞油酸、5-羥基二十碳四烯酸、前列腺素E2和白三烯B4含量升高，而馬尿酸含量下降。

討 論

本研究首次采用代謝組學技術對DM和DM-PTB患者血漿進行分析，篩選并發現DM患者并發PTB后體內代謝產物的改變，為在DM患者中早期篩查PTB并發情況提供了一定的理論依據。研究發現，患者的年齡、性別、DM病程等均與PTB的并發有關[9-10]。因此，為了減少以上混雜因素對實驗結果的影響，本研究對兩組研究對象的年齡、性別、DM病程等進行匹配。結果也顯示，兩組患者的以上指標之間差異均無統計學意義，達到了對研究對象的匹配和篩選目的。本研究中兩組研究對象的甘油三酯差異無統計學意義，但DM組患者的總膽固醇水平明顯高于DM-PTB組患者，這可能是DM患者在并發PTB后糖脂代謝改變所致[11]。

圖3為PCA得分；圖4為OPLS-DA得分；圖5為OPLS-DA模型隨機置換檢驗；t[1]：第一主成分；t[2]：第二主成分

表2 DM和DM-PTB患者血漿差異代謝物鑒定結果

類二十烷酸是重要的炎癥介質，主要參與體內炎癥和細胞免疫反應調節機制[12-13]。炎癥反應對PTB的病理生理至關重要，尤其是在PTB的致病過程中，嚴重影響宿主對結核分枝桿菌(MTB)的防御能力。研究表明，重度PTB患者的炎癥反應更為劇烈[14]。通過對兩組患者的代謝組進行比較，共篩選到7種差異代謝產物。除馬尿酸外，6-酮-前列腺素F1a等6種類二十烷酸在并發PTB的患者體內含量明顯升高，提示伴隨著PTB的并發，患者體內具有較高的MTB負荷量且炎癥反應劇烈，導致抗炎因子水平激增。研究發現，6-酮-前列腺素F1a和原卟啉原Ⅸ在PTB患者中含量增加，認為二者是PTB的生物標志物[15]。筆者也發現DM-PTB組中這兩種代謝產物含量均增高，與文獻報道一致，因此推測這兩種代謝物穩定存在于PTB患者中。

前列腺素和白三烯在MTB感染肺組織期間產生的。前列腺素E2是細胞間信號傳導的生物活性介質，參與PTB的生理病理過程。前列腺素E2在感染早期濃度較低，有利于抑制MTB的生長，晚期則高度表達約為前者的4倍[16]，使免疫效應下調。本研究中DM-PTB患者體內前列腺素E2水平升高，感染MTB的DM患者可能正處于感染晚期階段且具有較高的MTB負荷量[17]，進而加速了并發PTB的進程。該結果提示前列腺素E2是MTB感染的階段性反應產物，與DM并發PTB高度相關。此外，前列腺素E2還可以抑制細胞因子白細胞介素-12(IL-12)產生，而IL-12則決定著Ⅰ型免疫應答是否被誘導激活[18]。因此，高濃度的前列腺素E2可以抑制T細胞介導的免疫反應[16]，動物實驗也表明缺乏IL-12的小鼠結核病患病風險明顯增加[19]。因此，有研究將高水平前列腺素E2作為鑒別潛伏性肺結核和活動性肺結核的高度敏感指標[20]。可見，本研究將其作為篩選DM患者并發PTB的早期生物標志物是具有合理性的。白三烯是在5-脂氧合酶作用下產生的。白三烯B4參與T淋巴細胞活化和Th1細胞因子生成，如IL-12和γ干擾素(IFN-γ)，合成減少將明顯增加MTB的易感性[21]。研究表明，結核性腦膜炎患者中白三烯B4水平明顯升高[22]。本研究發現DM-PTB組中白三烯B4含量上升，與上述研究結果一致，主要歸因于感染期MTB的誘導作用。白三烯B4和前列腺素E2均產生于感染肺組織，具有雙重作用，但前者免疫刺激似乎比前列腺素E2的免疫抑制更為重要，這可能與前列腺素E2對結核病發病機制作用位置有關[21, 23]，而本研究發現白三烯B4的含量變化明顯高于前列腺素E2，暗示了以白三烯B4為主的保護性免疫反應更為劇烈，該結果與已有報道一致。因此，筆者推測DM-PTB患者白三烯B4的免疫保護作用優于前列腺素E2，考慮到白三烯B4和前列腺素E2作用相反，還應綜合二者水平變化及其比例關系，尋找更可能成為鑒別DM患者并發PTB的早期生物標志物。馬尿酸主要參與氨基代謝，被認為是DM的風險因素[24]。本研究發現馬尿酸在DM-PTB患者體內含量降低，提示DM患者在并發PTB后體內的氨基酸代謝可能發生改變。

綜上，本研究首次采用代謝組學技術對DM和DM-PTB患者血漿代謝組進行研究和比較，結果提示相對于未并發PTB的DM患者，并發PTB患者體內花生四烯酸代謝、亞油酸代謝、氨基酸代謝可能發生改變。但由于采樣困難，本研究的樣本量較小，容易產生抽樣誤差，因此需進一步擴大樣本量進行深入研究。