中華鱉Wnt4基因克隆及表達分析

張英萍，凌 晨，王利華，沙 航，鄒桂偉，胥 燾，羅相忠，梁宏偉

（1.上海海洋大學水產科學國家級實驗教學示范中心，上海 201306；2.中國水產科學研究院長江水產研究所，武漢 430223；3.上海海洋大學農業農村部淡水水產種質資源重點實驗室，上海 201306；4.三峽大學生物與制藥學院，湖北宜昌 443002）

Wingless 基 因 最 初 由 SHARMA 和CHOPRA［1］在果蠅（Drosophila melanogaster）中發現，其基因突變能導致果蠅翅膀的缺失，隨后一種原癌基因int1［2］從小鼠（Mus musculus）乳腺瘤病毒誘導的小鼠乳腺癌中被克隆，由于2個基因具有較高的同源性且功能相似，故將它們合稱為Wingless-type MMTV integration site family（Wnt）基因。Wnt基因家族是一類重要的分泌性糖蛋白信號分子，可以激活多種信號通路，在動物的早期發育及各種生命活動中發揮著重要作用［3～4］。從線蟲到哺乳動物均發現Wnt基因家族的存在［5］，其具有高度的保守性［6］。

Wnt4基因是Wnt基因家族重要的成員之一，與脊椎動物兩性生殖系統的發育有關［7］，介導Mullerian導管的初始形成，并調節類固醇生成的中腎細胞向發育中的性腺遷移［8～9］。在哺乳動物中，Wnt4基因已經被證實是卵巢分化的關鍵因子［10］。在小鼠中，Wnt4基因通過調節Follistatin基因的表達來參與卵巢發育［11］，雌性小鼠Wnt4的表達缺失導致XX性腺的雄性化［8］，而雄性中Wnt4的過表達則破壞睪丸血管和睪丸甾酮的合成［9］。在人體中，Wnt4與Dax1協同調控女性卵巢發育并阻止睪丸的形成［12］。Wnt4在哺乳動物調控性腺發育、調節繆勒氏管的形成、調控卵巢類固醇的生成及抑制睪丸的形成中起關鍵作用［13］。此外，Wnt4在哺乳動物中還參與了腎臟、腎上腺、乳腺和生殖系統的形成［7］。在魚類中，Wnt4與性腺發育密切相關。 在半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）中，Wnt4參與了性腺發育的整個過程，且在精巢表達水平高于卵巢［14］。在黑鯛（Acanthopagrus schlegeli）中，Wnt4被證實與卵巢發育和性別分化有關［15］。

中華鱉（Pelodiscus sinensis）屬爬行綱，龜鱉目，鱉科，鱉屬，俗稱甲魚、水魚、團魚［16］。在中國除西藏、青海和新疆外，各省市（自治區）均有分布，是我國重要的特種水產養殖對象之一，具有較高經濟價值和藥用價值［17］。在養殖過程中，雄性個體具有明顯的個體大、生長速度快、裙邊寬厚、營養價值豐富以及市場單價高等優勢，因此性別控制和全雄苗種培育一直以來都是中華鱉研究的重要方向。本研究通過克隆中華鱉Wnt4基因，分析其在雌雄個體不同組織中的表達特征、胚胎不同發育時期的表達特征以及Wnt激動劑對Wnt4基因表達的影響，進而探討Wnt4基因在中華鱉性別分化過程中的作用，以期為進一步開展中華鱉性別決定和性腺分化研究提供理論基礎，并為全雄苗種培育提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗所用中華鱉成鱉于2018年3月采自安徽省喜佳農業發展有限公司。中華鱉雌雄個體各3只，其中雄性平均體質量為（395.36±20.55）g，雌性平均體質量為（283.72±18.02）g，經麻醉后解剖收集腦、性腺、心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、腸和肌肉等組織樣品，置于 -80℃冰箱保存，用于總RNA的提取。中華鱉鱉卵于2018年5—6月收集自安徽省喜佳農業發展有限公司產卵場，置于溫度為（30.0±0.5）℃恒溫恒濕培養箱（濕度在80% ～85%）中進行孵化。

1.2 實驗試劑

Wnt激動劑（Wnt agonist 1是具有細胞透性的Wnt信號通路激活劑，誘導依賴于β-catenin和TCF-4的轉錄活性，Selleck公司），總RNA提取試劑Trizol Reagent（Invitrogen公司），PCR Mix和GoldenstarTMRT6 cDNA Synthesis Kit（北京擎科生物有限公司），SMARTer?RACE cDNA 5′/3′Kit（Takara），DNA凝膠純化試劑（南京諾維贊生物有限公司），PMD-18T載體（Takara）和DH5α感受態細胞（武漢清陽渡生物有限公司），無特殊說明的試劑均為國產分析純。

1.3 總RNA提取和cDNA第一條鏈合成

按照Trizol法提取總RNA，用超微量分光光度計 NP80 （德 國，IMPLEN）測 定 RNA 的OD260nm/OD280nm檢測RNA的質量、純度以及濃度，并用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性。用GoldenstarTMRT6 cDNA Synthesis Kit（北京擎科生物有限公司）和SMARTer?RACE cDNA 5′/3′Kit（大連，Takara）按照操作指南分別合成cDNA和RACE cDNA第一條鏈。

1.4 中華鱉Wnt4基因克隆

從NCBI數據庫中獲得海龜（Chelonia mydas）、三趾箱龜（Terrapene carolina triunguis）和美洲短吻鱷（Alligator mississippiensis）等物種Wnt4基因的cDNA序列，在保守區域設計簡并引物Wnt4-CF和Wnt4-CR（表1），以中華鱉卵巢組織cDNA為模板，進行PCR擴增。反應體系為50 L，反應程序為：98℃預變性2 min；98℃10 s，60℃10 s，72℃20 s，35個 循環；72℃延伸2 min，4℃10 min。利用DNA凝膠純化試劑盒（大連，Takara）回收目的片段產物。回收產物連接到PMD-18T載體（大連，Takara）上并轉化到大腸桿菌DH5α感受態細胞中，37℃培養過夜，挑取經菌落PCR檢測陽性克隆菌液測序。

基于獲得的中華鱉Wnt4基因片段的cDNA序列設計3′RACE引物Wnt4-3′-GSP和Wnt4-3′-NGSP，5′RACE 引物Wnt4-5′-GSP（表1）。以RACE cDNA第一條鏈為模板，GSP（Wnt4-3′-GSP和Wnt4-5′-GSP）和UPM（RACE試劑盒引物）為引物進行降落式PCR，反應程序如下：94℃5 min；94℃30 s，72℃3 min，5個 循環；94℃30 s，70℃30 s，72℃3 min，5 cycle；94℃30 s，68℃30 s，72℃3 min，25個循環。再以3′端降落式PCR產物50倍稀釋液為模板，Wnt4-3′-NGSP和UPM short（RACE試劑盒引物）為引物進行半巢式PCR反應，程序為：94℃5 min；94℃30 s，68℃30 s，72℃3 min，25個循環。PCR產物經純化、連接和轉化，挑取陽性克隆菌液測序。

1.5 序列分析以及同源性分析

用DNAMAN軟件包對獲得的5′cDNA和3′cDNA及中間序列進行全長拼接，在NCBI數據庫中利用在線ORF Finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）查找開放閱讀框（ORF）；利用ExPASy ProtParam工具預測Wnt4蛋白質的基本理化性質；利用SOPMA工具預測Wnt4蛋白二級結構；氨基酸的多重比對采用Clustal X和DNAMAN 完成；糖基化位點采用在線軟件NetNGlyc 1.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）預測，用Mega7.0中的鄰接法（NJ）構建系統進化樹，并采用1 000次自舉檢驗分析（bootstrap analysis）評估進化樹分支節點的置信度。

1.6 組織表達特征分析

基于獲得的中華鱉Wnt4基因cDNA全長序列用Primer 5.0設計實時熒光定量引物Wnt4-F和Wnt4-R（表1）。中華鱉18sRNA用作內參基因［18］，按照以下程序進行PCR擴增：95℃5 min；95℃15 s，60℃30 s，40個 循環；95℃15 s，60℃1 min，95℃15 s。數據采用相對表達量的計算方法，即基因相對表達量=2-△△Ct法，2-△△Ct值代表目的基因與對照組表達量之間的倍數差異［19］。數據采用平均值±標準誤差（mean±SD）表示，用SPSS22.0軟件進行單因素方差分析（one-way ANOVA），使用Turkey多重比較法進行差異顯著性分析，P＜0.05為顯著性差異。

1.7 胚胎不同發育時期表達特征

按照TOKITA和KURATANI［20］胚胎分期標準采集30℃孵化條件下中華鱉胚胎發育的第14～21期胚胎樣品，置于液氮中速凍，然后轉移到 -80℃冰箱中保存。采用本實驗室開發的性別標記進行胚胎性別鑒定［21］后進行熒光定量表達分析。

1.8 Wnt激動劑對Wnt4基因表達量的影響

依據已有研究報道得知：孵化溫度為30℃時，孵化至第9天生殖嵴隆起，孵化至第15天原始性腺形成，孵化至第26天完成性腺分化［22］。因此我們在孵化至第15天原始性腺形成時，使用Wnt激動劑對胚胎動物極注射處理，用微量進樣器分別注射1.0 g·L-1、2.5 g·L-1和5.0 g·L-1的Wnt激動劑各1 L，對照組dd H2O 1 L，用石蠟封口，繼續孵化。收集注射后0、6、12、24、36、48、72、96、120、144、168 h胚胎樣品，用于定量表達。

2 結果與分析

2.1 中華鱉Wnt4基因全長cDNA序列特征和系統進化

中華鱉Wnt4 cDNA序列全長為2 432 bp，開放閱讀框（ORF）為1 095 bp，編碼364個氨基酸，5′-UTR 48 bp和3′-UTR 1 289 bp（圖1）。Wnt4蛋白含有2個N-糖基化位點分別位于N-109和N-310處，具有Wnt基因家族特有保守片段“CKCHGVSGSC”、24個Wnt蛋白家族重要的半胱氨酸保守序列。用在線工具ExPASy對中華鱉Wnt4蛋白的二級結構進行預測，二級結構中無規則蜷曲（c）占46.98%、α-螺旋（h）占38.74%、延伸鏈（e）占9.89%、β轉角（t）占4.4%。

不同物種Wnt4氨基酸序列分析結果見表2，中華鱉與海龜、三趾箱龜、美洲短吻鱷、達馬拉鼴鼠（Fukomys damarensis）、裸鼢鼠（Heterocephalus glaber）、人（Homo sapiens）、小鼠、斑馬魚（Danio rerio）、牙鲆（Paralichthys olivaceus）、半滑舌鰨、櫛孔扇貝（Azumapecten farreri）和厚殼貽貝（Mytilus coruscus）同源性如表2所示，與海龜和三趾箱龜的同源性最高。

表1 中華鱉Wnt4基因擴增引物信息Tab.1 Information of primers for Wnt4 amplification in Pelodiscus sinensis

中華鱉Wnt4蛋白與海龜、三趾箱龜、美洲短吻鱷、裸鼢鼠、人、小鼠、斑馬魚、牙鲆、半滑舌鰨、櫛孔扇貝和厚殼貽貝等11個物種的蛋白序列多重比較分析見圖2，其序列比較保守，與其他物種有100多個Wnt保守位點。

基于鄰接法（NJ）構建Wnt4蛋白氨基酸序列系統進化樹（圖3），結果為三大支，哺乳動物和爬行動物聚為一大支，其中哺乳類和爬行動物分別聚為一支：中華鱉與海龜、三趾箱龜和美洲短吻鱷等爬行動物聚為一支。硬骨魚類聚為一大支，貝類聚為一大支。

表2 不同物種與中華鱉Wnt4蛋白氨基酸序列同源性比對Tab.2 Comparative identity of amino acid sequence of Wnt4

2.2 Wnt4基因在中華鱉組織中的表達特征

Wnt4基因在中華鱉雌雄個體不同組織中的表達結果表明，Wnt4基因普遍存在于中華鱉的腦、性腺、心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、腸以及肌肉等組織中，且廣泛表達，但是表達存在一定的組織和性別特異性（圖4）。性腺中表達量最高，肺次之；并且雌性卵巢表達顯著高于雄性精巢（P＜0.05），具有顯著的性別二態性。腦、心臟、肝臟、脾臟、腎臟、腸和肌肉中，Wnt4表達量顯著低于性腺和肺（P＜0.05）。肝臟中雄性的表達顯著高于雌性（P＜0.05），而在腦、肺、腎臟和肌肉中，雌性表達顯著高于雄性（P＜0.05）。

2.3 Wnt4基因在中華鱉胚胎不同發育時期的表達特征

為研究Wnt4基因在中華鱉性腺分化中的作用，采用qRT-PCR方法分析中華鱉Wnt4基因在雌雄中華鱉胚胎不同發育時期中的表達情況，結果如圖5所示，Wnt4基因在性腺分化前的第14期已經有表達，性腺開始分化后在雌性胚胎中表達持續高于雄性（P＜0.05），在第20期和21期雌性胚胎中的表達極顯著高于雄性胚胎（P＜0.01），表達呈現性別二態性。

2.4 Wnt激動劑對中華鱉Wnt4基因表達的影響

為研究Wnt激動劑對中華鱉性別發育的影響，采用qR T-PCR方法分析了注射Wnt激動劑后中華鱉胚胎發育過程中Wnt4基因的表達水平。不同濃度Wnt激動劑處理后Wnt4基因的相對表達如圖6所示。

在雌性胚胎中，注射1.0 g· L-1和2.5 g·L-1的Wnt激動劑后，6～12 h表達顯著低于對照組（P＜0.05）（圖6-A，C），72 h表達達到最大峰值，96 h表達顯著降低（P＜0.05）。注射5 g·L-1的Wnt激動劑后，在6～24 h內Wnt4表達與對照組無顯著性差異（P＞0.05）（圖6-E），在36 h表達顯著增加（P＜0.05），72 h表達達到最大峰值，96 h后表達逐漸降低，Wnt4表達量顯著高于對照組（P＜0.05）。

在雄性胚胎中，注射1.0 g·L-1Wnt激動劑后，6 h后顯著上調Wnt4的表達（P＜0.05）（圖6-B），36 h表達達到最大峰值，48 h后表達逐漸降低，72 h后表達顯著低于對照組（P＜0.05）。注射2.5 g·L-1Wnt激動劑后，6 h顯著上調Wnt4的表達（P＜0.05）（圖6-D），96 h表達達到最大峰值，120 h時表達開始顯著降低（P＜0.05）。注射5 g·L-1Wnt激動劑后，6～96 h表達逐漸上升，Wnt4表達顯著高于對照組（P＜0.05）（圖6-F），96 h表達達到最大峰值，120 h時表達開始顯著降低（P＜0.05），但顯著高于對照組（P＜0.05）。

在雌性胚胎中，注射1.0 g·L-1Wnt激動劑，Wnt4基因在36～144 h表達上調；濃度2.5 g·L-1時，在24～168 h表達上調；濃度5.0 g·L-1時，在24～168 h表達上調。在雄性胚胎中注射1.0 g·L-1Wnt激動劑，Wnt4基因在6～36 h表達上調；濃度2.5 g·L-1時，在6～96 h表達上調；濃度5.0 g·L-1時，在6～168 h表達上調。在胚胎中，隨著注射濃度的增加，Wnt激動劑的作用時間總體上更持久。

3 討論

Wnt信號通路是在進化上高度保守的信號途徑，在胚胎發育、細胞分化、增殖以及凋亡等生理過程中均發揮了重要的調控作用，已經成為細胞生物學和分子生物學研究的一大熱點［23］。本研究得到的Wnt4基因cDNA序列全長為2 432 bp，編碼364個氨基酸，具有24個Wnt蛋白家族重要的半胱氨酸保守序列，2個N-糖基化位點且有100多個保守位點，符合Wnt結構特點［2］。中華鱉Wnt4與同為龜鱉目的海龜和三趾箱龜同源性最高，達91.74%，與其他物種的同源性也較高。

Wnt4基因在哺乳動物［24-25］、魚類［26-27］、貝類［28-30］、蝦蟹類［31］等生物中的不同組織中均存在表達，Wnt4基因表達具有廣泛性且其功能具有多樣性，其可能參與了多種組織細胞的生命過程。中華鱉Wnt4基因在腦、性腺、心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、腸和肌肉等組織均有表達。Wnt4基因在中華鱉中同樣具有多種功能，推測其可能參與了多種組織細胞的生命過程。Wnt4基因與多種動物的性別決定和性別分化密切相關，Wnt4基因突變，會導致性腺發育異常甚至性反轉［7-9，11］。Wnt4基因缺失的小鼠可導致雌性胚胎發生雄性化［8］。BARRIONUEVO 等［32］研 究 發 現，小 鼠Wnt4基因在性別決定之前的性腺中存在表達，性別分化后在卵巢中仍持續表達，精巢中的表達顯著下調，Wnt4基因參與雌性性別分化過程。本研究中華鱉Wnt4基因在性別分化前的第14期就在雌性胚胎中高表達，且在之后的胚胎發育過程中一直維持雌性高表達，雌性胚胎中的表達顯著高于雄性胚胎中的表達，Wnt4基因同樣也參與了中華鱉雌性性腺分化的過程。Wnt4基因發生突變會引起性腺發育異常甚至性反轉［7，9，11］。Wnt信號通路是哺乳動物性別決定的關鍵因子［7］，但其作用機制仍不清楚。本研究中Wnt激動劑能上調中華鱉Wnt4基因的表達，隨著濃度的增加Wnt4基因上調表達水平變高，推測其對性別發育有一定的作用，而其作用機制和對性別發育的作用還有待進一步研究。

本研究獲得中華鱉Wnt4基因的cDNA全長序列，并分析序列特征、表達特征以及Wnt激動劑對其表達的影響。中華鱉Wnt4基因表達具有廣泛性和一定的組織特異性，可能參與多種組織生物學過程，尤其是在卵巢發育或其功能維持上起關鍵作用，參與了中華鱉雌性性腺分化過程，結果有助于中華鱉性別分化分子機制的進一步研究。