呋喃唑酮代謝物在中華絨螯蟹體內消除規律

黃宣運，沈曉盛，史永富，蔡友瓊

（中國水產科學研究院東海水產研究所，農業農村部水產品質量安全與風險評估實驗室（上海），上海 200090）

呋喃唑酮（furazolidone）又名痢特靈，是一種人工合成的硝基呋喃類廣譜抗生素，通過干擾細菌氧化還原酶起到殺菌作用［1］，可用于水產動物胃腸道疾病的預防與治療［2］。從1993年開始，歐盟最先禁止在動物養殖過程中使用呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃它酮和呋喃妥因等硝基呋喃類藥物，主要原因是它們的代謝物具有潛在的致突變和致癌風險［3］。研究表明，呋喃唑酮在動物體內可迅速代謝為3-氨基-2-惡唑烷酮（AOZ），且可較長時間殘留在動物體內［4］。歐盟規定硝基呋喃類代謝物在水產品中的最低要求執行限為1.0 μg·kg-1［5］。我國規定水產品動物中不得檢出硝基呋喃類代謝物［6］，目前的判定依據與歐盟一致。

雖然硝基呋喃類藥物屬于禁用藥物，但違規使用現象仍時有發生［7］，鑒于監管和風險評估的需要，已在羅非魚［8-9］、海參［10］、雜交鱧（Channa maculata × C.argus）［11］、牙 鲆（Paralichthys olivaceus）［12］、大菱鲆（Scophthalmus maximus）［13］、斑 點 叉 尾 鮰（Ietalurus punetaus）［14］以 及 對蝦［15-16］等水產動物中開展了硝基呋喃類代謝物的藥代動力學研究。對于中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis，以下簡稱河蟹），僅開展了呋喃西林代謝物的消除規律研究［17-18］，而對呋喃唑酮代謝物消除規律的研究尚未見諸報道。本研究以河蟹扣蟹為給藥對象，研究了模擬實際養殖條件下的呋喃唑酮代謝物消除規律，評估了河蟹苗種期間使用呋喃唑酮藥物的殘留風險，以期為上市河蟹食品安全保障提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 主要試劑

AOZ和AOZ-D4，含量≥99%，購于德國Dr公司。呋喃唑酮原藥（含量≥98%）購于衢州偉榮藥業有限公司。乙酸乙酯、甲醇、正己烷等為色譜純，其余試劑均為分析純。

1.1.2 主要儀器

Thermo TSQ Quantum Ultra高效液相色譜串聯質譜儀（美國Thermo公司）；PHS-25酸度計（上海偉業儀器廠）；Mili-Q 純水儀（法國Millipore）；Biofuge Primo R離心機（美國Thermo公司）；FA1004電子天平（上海精天電子儀器廠）；BSA2202SCW 電子天平（賽多利斯科學儀器（北京）有限公司）；SHA-CA恒溫水浴搖床（金壇市迅生儀器廠）；N-EVAP-111氮吹儀（美國Organomation）。

1.1.3 實驗動物及場地

實驗用蟹規格為（13±2）g的健康扣蟹（約7 500只，雌雄性別比約為1∶1）購自上海市崇明興陸養殖合作社。實驗開始前，隨機抽取18只河蟹分為3組，取其肌肉、肝胰腺、鰓組織進行AOZ測定，結果均為未檢出AOZ。藥餌制備：將呋喃唑酮原粉與粘合劑（玉米淀粉）混勻后，加入溫水調和，再按照每3 000 mg· kg-1和9 000 mg·kg-1比例加入飼料混勻，攝食率按1%計算。

養殖實驗在面積為300 hm2、水深為1.2 m的室外養殖池塘進行，實驗前對水體和底泥中呋喃唑酮及AOZ殘留進行檢測，結果均未檢出。養殖期間水溫保持在20.0～27.5℃。

鍋爐汽包水位自動調節的任務是使給水量與鍋爐的蒸發量相平衡，并維持汽包中的水位在工藝允許的范圍內。水位過高，會影響汽包內汽水分離效果，使汽包出口的飽和蒸汽帶水增多，造成不良后果；水位過低則造成水的急速蒸發，汽水自然循環破壞，鍋爐壁容易被燒壞，嚴重時會造成爆炸事故。

1.2 實驗方法

1.2.1 給藥方法

將實驗扣蟹暫養7 d后，將7 500只扣蟹隨機平均放入P1組、P2組和對照組P0。將P1組、P2組和P0組分別飼養于4 m ×2 m ×1 m的自制鐵網籠中，放入池塘。其中P1組和P2組每次投喂劑量分別為30 mg·kg-1和90 mg·kg-1的藥餌，對照組投喂河蟹飼料，3組的投喂量保持一致。每天投喂2次（早上8∶00和下午3∶00各1次），連續投喂5 d。最后1次投喂后1 h，將河蟹表面清洗干凈，轉入池塘。按照河蟹常規養殖方法進行養殖［19］。

1.2.2 取樣方法

實驗樣品分別按照最后1次給藥后的1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h、96 h、192 h、288 h、384 h、480 h、720 h、960 h、1 200 h、1 440 h、1 920 h、2 400 h、2 880 h和3 600 h進行取樣。根據河蟹的生長狀況，實驗的前1 440 h，每6只河蟹為1個樣品，實驗1 440 h后，每3只河蟹為1個樣品，每個樣品分別取其肌肉、肝胰腺和鰓3個組織，樣品置于-18℃冰箱中待測。

1.2.3 AOZ前處理方法

準確稱取2.00 g（精確到0.01 g）樣品置于30 mL離心管中，依次加入50μL內標工作液（100.0 ng· mL-1）、5 mL 鹽 酸 溶 液（0.5 moL·L-1）和150μL 2-硝基苯甲醛溶液（0.05 moL·L-1），渦旋1 min后，置于恒溫水浴搖床37℃避光振蕩16 h。取出離心管冷卻至室溫，加入5 mL磷酸氫二鉀溶液（0.76 moL·L-1），調節pH至7.0～7.5，加入8 mL乙酸乙酯，渦旋1 min，離心5 min，取有機相至離心管中，40℃氮氣吹干。加入1.0 mL 5%甲醇水溶液溶解殘留物，過0.22μm水相膜，供上機分析。

色譜柱為CAPCELL PAK C18（100mm×2.0 mm i.d.，5μm），柱溫為30℃，進樣量為10μL。流動相為0.1%甲酸（含2 mmol·L-1乙酸銨）（A）和甲醇（B）。流動相梯度洗脫程序如表1。

1.2.5 AOZ質譜條件

測定時設置為ESI+離子模式，離子傳輸管和氣化室溫度均為300℃，鞘氣（N2）和輔助氣（N2）壓力分別為35 psi和8 psi，碰撞氣（Ar2）壓力為1.5 mTorr，采用選擇多反應監測掃描模式；碎片離子及碰撞能量見表2。

表1 流動相梯度洗脫程序Tab.1 Program of mobile phase gradient elution

表2 選擇反應監測的定性離子、定量離子與碰撞能量Tab.2 Qualitative ions，quantitative ions and collision energy condition for selected reaction monitoring

1.2.6 標準工作曲線繪制與測定

配置1、2、5、20、40、100 ng·mL-1AOZ系列標準溶液，按1.2.3的分析條件進行處理。以AOZ與內標衍生物的峰面積比為縱坐標，AOZ濃度為橫坐標，繪制標準曲線，求出回歸方程和相關系數。

1.2.7 數據處理

參考徐維海等［9］的方法，計算呋喃唑酮代謝物平均消除速率（v），單位為μg·（kg·h）-1，計算公式如下：

式中：Cmax為消除過程中測得AOZ的最高濃度（μg·kg-1），Cmin為消除過程中測得的最低濃度（μg·kg-1），t1為測到Cmax所對應時間（h），t2為測到Cmin所對應時間（h）。

2 結果與分析

2.1 方法檢出限和定量限

實驗結果（圖1）表明，AOZ在1.0～100 ng·mL-1范圍內線性關系良好，回歸方程為：Y=0.024 092 1+0.092 585 6X，相關系數R2≥0.999 3。經加標實驗確定方法檢出限0.25 μg·kg-1（S/N≥3），定量限為0.5μg·kg-1（S/N≥10），回收率在80% ～110%之間，滿足檢測AOZ的定性和定量分析。

2.2 河蟹肌肉中AOZ的消除規律

從扣蟹到成蟹養殖過程中河蟹肌肉中AOZ含量的消除規律如圖2所示。 肌肉中AOZ含量呈波動下降趨勢，前期（1～288 h）下降速度較快，后期下降速度明顯降低。兩組不同濃度處理河蟹的AOZ在肌肉中的變化趨勢基本一致。最高峰值均出現在最后1次給藥后的1 h，其值分別為（172.0±7.2）、（952.0±75.2）μg·kg-1；第2個高峰均出現在48 h，其值分別為（77.0±7.9）、（217.0±14.9）μg·kg-1。第3個高峰僅在P2組出現（192 h），含量為（217.0±14.9）μg·kg-1。P1組河蟹肌肉中的AOZ在720 h時已經降低到（1.2±0.2）μg·kg-1。P1組河蟹肌肉中的AOZ含量低于判定限（1.0μg·kg-1）的時間為停止給藥后的960 h。根據公式計算得到P1組河蟹肌肉中AOZ的平均消除速率為0.238 μg·（kg·h）-1。P2組河蟹肌肉中的AOZ含量在1 200 h時下降為（1.3±0.2）μg·kg-1，肌肉中AOZ含量低于判定限所需時間為停止給藥后的1 440 h。根據公式計算得到P2組河蟹肌肉中AOZ的平均消除速率為0.767μg·（kg·h）-1。P2組的最高濃度是P1組的5.5倍，代謝時間比P1組長480 h，平均消除速率為P1組的3.2倍。

2.3 河蟹肝胰腺中AOZ的消除規律

整個消除階段，河蟹肝胰腺中AOZ含量消除規律如圖3所示。將圖3與圖2對比發現，河蟹肝胰腺與肌肉中AOZ的變化趨勢基本一致。兩試驗組河蟹肝胰腺中AOZ的最高峰值均出現在最后1次給藥后的1 h，其值分別為（347.0±25.2）（P1）、（2 475.2±128.3）（P2）μg·kg-1。第二個高峰均出現在48 h，其值分別為（217.0±14.9）（P1）、（752.0±34.5）（P2）μg·kg-1。第三個高峰均出現192 h，其值分別為（156.0±16.4）（P1）、（491.0±25.8）（P2）μg·kg-1。P1組河蟹肝胰腺中的AOZ降低到判定限（1.0 μg·kg-1）附近，所需時間為960 h，P2組為1 440 h。P1組河蟹肝胰腺中的AOZ低于判定限所需時間為1 200 h，P2組為1 920 h。根據公式計算，P1組肌肉中AOZ的平均消除速率為0.361 μg·（kg·h）-1，P2組為1.72μg·（kg·h）-1。

2.4 河蟹鰓中AOZ的消除規律

整個消除階段，與肌肉和肝胰腺變化趨勢一致，鰓中AOZ呈現波動下降趨勢（圖4）。鰓中AOZ在停藥后1 h達到最高值，其值分別為（196.0±17.7）（P1）、（786.0±40.9）（P2）μg·kg-1，低于同期肝胰腺組織中AOZ的含量。與肌肉和肝胰腺相比，鰓中AOZ的下降速率最慢。P1組鰓中的AOZ降低到判定限（1.0 μg·kg-1）附近，所需時間為960 h，P2組為1 440 h，其值分別為（1.2±0.1）、（2.2±0.1）μg·kg-1。P1組鰓中的AOZ低于判定限所需時間為1 440 h，P2組為1 920 h。根據公式計算，P1組肌肉中AOZ的平均消除速率為0.136 μg·（kg·h）-1，P2組為0.409μg·（kg·h）-1。

3 討論

3.1 河蟹不同組織中AOZ的消除規律

在停藥后的1 h，各組織中AOZ的含量均達到最高值，肝胰腺中AOZ的含量高于肌肉和鰓組織，其主要原因為肝胰腺是體內藥物代謝的主要器官，藥物進入機體后，部分藥物直接進入肝胰腺，還有部分藥物可通過血液循環進入肝胰腺，從而導致肝胰腺中AOZ含量高于其他組織［20］。各組織中AOZ也以肝胰腺消除速率最快，以P1組為例，肝胰腺中AOZ消除速率為肌肉的1.5倍，為鰓的2.7倍。此外，河蟹各組織消除過程中均出現多峰現象，這在水產品中藥物代謝中較為常見［14-15，21］，其主要原因可能與腸-肝循環、胃腸循環的非齊性有關［21］，但對于產生的機理仍有待進一步研究。在本實驗中，P2組河蟹各組織AOZ的消除速率均高于P1組，其原因可能是AOZ在河蟹體內的消除為一級動力消除，藥物在體內濃度越高，消除速率越快，當藥物濃度降低后，消除速率逐漸下降。

3.2 不同物種中AOZ的消除規律

在本實驗中，各組織中AOZ含量降低至判定限（1.0μg·kg-1）的最短時間為960 h，最長時間為1 920 h。譚志軍等［13］研究報道，以15 mg·kg-1（體質量）劑量，每天投喂2次，連續投喂5 d，在185 d時，大菱鲆肌肉中AOZ的含量為（29.68±4.11）μg·kg-1。劉永濤等［22］研究報道，以100 mg·kg-1（體質量）劑量，每天投喂2次，連續投喂5 d，在停止給藥90 d后，斑點叉尾鮰肌肉中AOZ降低至檢測不出水平。AOZ在體內殘留時間較長，主要原因可能與AOZ能夠與體內蛋白質以共價鍵形式緊密結合有關［23］。AOZ在不同物種中殘留時間存在較大差異，這可能與給藥劑量、實驗溫度、富集濃度、養殖環境等因素有關［18］，也可能是不同物種之間的差異造成的。

4 小結

本實驗以河蟹扣蟹為研究對象，模擬實際用藥和養殖條件，系統研究了AOZ在河蟹體內的消除規律。實驗結果表明，整個消除階段，AOZ在河蟹體內消除呈現前快后慢的規律。AOZ在河蟹各組織中殘留時間長，最長可達1 920 h。因此，在養殖過程中，應遵守相關規定禁止使用呋喃唑酮，同時還要加強管理，避免（苗種、飼料、漁藥等）投入品帶入呋喃唑酮，造成不必要的損失。