鯊魚硫酸軟骨素及膠原蛋白復方改善小鼠骨關節炎作用研究

顏晨燕，王梨萍，屈 鑫，李 鋒，3，石賢愛，3

（1.福州大學生物科學與工程學院，福州 350106；2.福州大學藥物生物技術與工程研究所，福州 350106；3.福建省醫療器械與生物醫藥省重點實驗室，福州 350106）

硫酸軟骨素（chondroitin sulfate，CS）是一類結構復雜的糖胺聚糖，其結構基本單元為D-葡萄糖醛酸與N-乙酰-D-氨基半乳糖通過1，3-糖苷鍵連接形成的二糖，二糖單元之間通過β-1，4-糖苷鍵連接而成。CS在動物體內廣泛存在，多位于動物軟骨中，是結締組織的重要組成部分。近年來研究表明，CS具有多方面的生物活性。CS可降低血脂含量，抑制血栓的生成，具有調血脂和預防動脈粥樣硬化的作用［1］；在抗關節炎方面，CS也具有顯著的作用，CS可抑制機體關節損傷因子如基質金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP-9）、IL-1β的產生，從而延緩軟骨損傷的進展，起著緩解關節炎的作用［2］；CS還能促進成骨細胞生長，誘導新骨生長，加速骨損傷的愈合過程［3］。此外，CS還具有抗氧化、延緩衰老、抗腫瘤以及抗黏連等作用，因而在臨床上被廣泛應用［4］。膠原蛋白為細胞外基質結構蛋白，在動物體內廣泛存在，主要存在于動物的皮膚和骨組織中。膠原蛋白最顯著的結構特點是三螺旋結構，由3條α多肽鏈纏繞形成超螺旋結構。膠原蛋白的結構穩定，具有低免疫原性和良好的生物相容性，因而用途廣泛［5］。近年來研究表明，膠原蛋白還具有調血脂、抗腫瘤、抗關節炎、免疫調節等方面的生物活性［6］，因而也被大量應用在膳食補充及醫療方面。

骨關節炎（osteoarthritis，OA）是一種慢性關節退行性疾病，其臨床特征主要為關節軟骨損傷、關節邊緣骨贅形成和滑膜炎癥等［7］。OA的發生發展與衰老、運動損傷等因素密切相關［8-9］。軟骨損傷是OA最主要的病因，關節的整體穩態同時依賴于相關組織的相互作用，包括骨和滑膜組織。在OA的發生發展中，軟骨下骨將出現病變硬化，且隨著病情的發展其病變程度將越來越明顯［10］。到目前為止，在臨床上尚無有效的無創性治療方法能逆轉退行性關節炎的發生發展［11］。

鯊魚（Carcharhiniformes）屬于脊椎動物門，軟骨綱，板鰓亞綱，在世界各大洋都有廣泛分布，是我國重要的海洋魚類資源［12］。鯊魚頭骨及椎骨均為軟骨，含有豐富的硫酸黏蛋白、骨膠原蛋白成分［13］，鯊魚鰭骨中也含有豐富的粘多糖和膠原蛋白［14］。作為魚翅及相關產品的加工下腳料，鯊魚軟骨并未得到充分的利用，大多被直接丟棄，造成極大資源浪費，并帶來了環境污染問題。盡管有部分研究者研究了硫酸軟骨素對骨關節炎的改善作用［15-16］，但通過口服補充膠原蛋白，是否對骨關節炎有改善作用尚未可知，膠原蛋白和硫酸軟骨素復方用于改善骨關節炎方面的研究尚未見報道。基于此，在本實驗室前期研究的基礎上，本研究將源自鯊魚軟骨的高純度硫酸軟骨素及膠原蛋白進行復方配伍，以考察其對注射膠原蛋白酶所致的小鼠膝關節炎的改善作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

鯊魚硫酸軟骨素，由本實驗從鯊魚軟骨中分離制備，純度≥95%；鯊魚膠原蛋白，由本實驗從鯊魚軟骨中制備，純度≥90%；以上兩者按照質量比2∶1混合制得鯊魚硫酸軟骨素和膠原蛋白復方（shark chondroitin sulfate and collagen complex，SCC）；Ⅱ型膠原蛋白酶（酶活性為125 U·mg-1），購自美國Sigma公司；IL-1β、IL-4酶聯免疫吸附檢測試劑盒，RayBiotech公司；番紅-O染色試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；天狼猩紅染色試劑盒，上海翊圣生物科技有限公司；Masson染色試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；H&E染色試劑，福州邁新生物技術開發有限公司。

1.1.2 實驗動物

健康10周齡雄性昆明小鼠，購自上海斯萊克實驗動物公司（SCXK滬2012-0002），在標準條件下分組飼養，共分4組，每組8只小鼠，具體分組為陰性對照組、OA模型組、SCC高劑量組、SCC低劑量組。實驗過程中小鼠自由飲食及攝食。本研究遵循《實驗動物保護條例》相關規定。

1.1.3 主要儀器

RM2245組織切片機，德國徠卡公司；KD-P組織攤片機，浙江科迪公司；SH-1000熒光全自動酶標儀，日本Corona公司。

1.2 方法

1.2.1 建立動物模型

為了誘導OA，參考已報道的造模方法［16］，稍作改動，簡述如下。取1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠，剃去右膝膝關節部位毛并消毒后，通過髕下韌帶在右膝關節間隙注射5U （體積4 μL）Ⅱ型膠原蛋白酶（溶于無菌生理鹽水中，酶活性為125 U·mg-1）。陰性組注射4μL無菌生理鹽水作為對照。注射時將針的注射深度限制在1.5 mm，以免損傷關節軟骨。

在實驗的第0、2、4、6天各注射一次Ⅱ型膠原蛋白酶，每日觀察關節腫脹情況，持續觀察4周，記錄并拍照。

1.2.2 給藥

各組別均每日灌胃。SCC高劑量組按照300 mg·kg-1每日固定灌胃給藥，SCC低劑量組為150 mg·kg-1；陰性對照與OA模型組每日取等體積生理鹽水灌胃。藥物干預4周后處死動物取血清，解剖后取小鼠關節，剔除肌肉后，用游標卡尺測量左右關節橫向直徑并計算關節腫脹度（%），計算公式為：腫脹度（%）=（右膝關節直徑-左膝關節直徑）/左膝關節直徑 ×100。之后，將膝關節脫鈣處理，進行病理切片染色分析。

1.2.3 關節病理切片及染色分析

取關節在室溫下用5%硝酸脫鈣10 h，后浸泡于4%多聚甲醛中24～48 h，梯度乙醇脫水（50%、70%、80%、90%和100%乙醇各1 h）、透明后常規組織包埋，組織切片做H&E染色以觀察軟骨形態。切片脫蠟水化后分別采用番紅-O染色試劑盒、Masson染色試劑盒以及天狼猩紅染色試劑盒按照說明書操作進行染色。番紅-O染色結果軟骨呈紅色，骨呈藍色或綠色；Masson染色結果膠原纖維、粘液、軟骨呈藍色，胞漿、肌肉、纖維素、神經膠質呈紅色，胞核呈黑藍色；天狼猩紅染色結果膠原纖維呈紅色，肌肉、神經膠質、胞漿、紅細胞呈黃色。

1.2.4 酶聯免疫吸附

小鼠眼球取血后斜放于冰上3 h，3 500 r·min-1離心20 min，分離血清。取IL-1β和IL-4酶聯免疫吸附試劑盒按照說明書操作，檢測在血清中的表達水平，每個組別檢測3次，根據標準曲線計算出各組別的平均表達量。

1.3 數據處理

所有實驗均重復至少3次，實驗結果采用單因素方差統計法（T檢驗，P＜0.05）進行分析比較，用Origin 9.1軟件進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 形態學觀察

如圖1和圖2所示，造模4周后觀察小鼠關節腫脹情況，可見模型組小鼠注射Ⅱ型膠原蛋白后右側關節較左側關節明顯腫脹（圖1-B）。實驗第3周，可觀察到給藥組動物的關節腫脹程度逐漸減輕。最終實驗結果顯示，SCC低劑量（150 mg·kg-1）干預具有一定程度的抑制膝關節腫脹作用（圖1-C）。相比低劑量，SCC高劑量（300 mg·kg-1）干預抑制關節腫脹作用更為明顯（圖1-D）；各組小鼠膝關節腫脹度情況比較如圖2所示，藥物干預組動物的膝關節腫脹程度明顯低于模型對照組。

2.2 H＆E染色分析

如圖3所示，模型組軟骨細胞具有一定程度增殖，部分部位出現纖維肉芽組織填充（黑色箭頭），軟骨細胞分布不均勻，成混亂排列（圖3-B）；與模型組相比，SCC低劑量（150 mg·kg-1）干預可改善軟骨細胞分布，纖維肉芽組織消失（圖3-C）。SCC高劑量（300 mg·kg-1）干預后關節軟骨表面光滑，軟骨四層結構比較清晰，排列規律，軟骨細胞呈類圓形，細胞核紫藍色，細胞質粉紅色，細胞排列整齊，分布及染色均勻（圖3-D）。

2.3 Masson染色分析

由于軟骨和骨的細胞外基質中普遍分布著膠原纖維，因此Masson染色基質部分呈大面積藍色，膠原纖維分為多種類型，軟骨中主要為Ⅱ型膠原，骨組織中則主要為Ⅰ型膠原。圖4顯示了膠原（黑色箭頭）在關節中的分布情況，與陰性對照組相比，模型組的軟骨層中膠原纖維含量顯著降低（圖4-B），表明膝關節軟骨受到明顯損傷。與模型組相比，SCC低劑量干預（150 mg·kg-1）可使軟骨層的膠原含量明顯增加（圖4-C），SCC高劑量（300 mg·kg-1）干預也可顯著增加膠原含量，但相比低劑量增加并不明顯。以上結果表明，SCC給藥后可明顯改善OA中膠原纖維流失狀況。

2.4 天狼猩紅染色分析

天狼猩紅染色是利用兩種陰離子染料混合成的試劑進行染色的一種方式，對膠原的顯示也較為明顯，在該染色法中膠原組織顯紅色。如圖5染色結果所示，與陰性對照組相比，模型組的膠原組織（黑色箭頭）含量明顯減少（圖5-B），表明軟骨組織出現明顯損傷。與模型組相比，SCC低劑量（150 mg·kg-1）干預可明顯增加膠原含量（圖5-C），SCC高劑量（300 mg·kg-1）干預可更大程度提升膠原含量（圖5-D）。以上結果進一步證實了針對OA給予SCC干預可有效補充關節中膠原蛋白含量，從而減輕癥狀。

2.5 番紅-O染色分析

軟骨組織由軟骨細胞和軟骨基質組成，軟骨組織及其周圍的軟骨膜構成軟骨。軟骨根據基質內所含纖維素成分不同分為透明軟骨、彈性軟骨、纖維軟骨。番紅O著色與陰離子的濃度近似成正比關系，間接反映基質中蛋白多糖的含量和分布。當軟骨受到損傷時，軟骨中的糖蛋白會釋放出來，使基質成分分布不均勻，從而導致番紅O淡染或不著色。由圖6可知，與陰性對照組相比，模型組軟骨組織著色明顯較淺，且著色分布不均勻，表明軟骨中糖蛋白（黑色箭頭）流失明顯，軟骨組織受到明顯損傷（圖6-B）。與模型組相比，SCC低劑量（150 mg·kg-1）處理可顯著增加著色程度，但著色分布還不太均勻（圖6-C），表明SCC低劑量處理對軟骨損傷有一定程度的修復作用。相比低劑量處理，SCC高劑量（300 mg·kg-1）處理既能增加軟骨組織的著色程度，也能提升著色的均勻度（圖6-D），表明在該劑量下，SCC處理具有較好地修復OA軟骨組織的作用。

2.6 血清IL-1β和IL-4表達水平分析

通過ELISA法分析各組動物血清中IL-1β和IL-4的表達量，結果如圖7所示。模型組造模后小鼠血清IL-1β的表達水平顯著高于陰性對照組（P＜0.05，圖7-A），而與此相反的是，模型組動物血清IL-4的表達水平顯著低于陰性對照組（P＜0.05，圖7-B）。與模型組相比，低劑量給藥組（150 mg·kg-1）的兩種細胞因子的血清表達水平均有一定的改善，但不具有顯著性。高劑量組（300 mg·kg-1）動物的血清IL-1β水平顯著低于模型組（P＜0.05，圖7-A），血清IL-4的水平顯著高于模型組（P＜0.05，圖7-B）。以上結果表明，SCC給藥干預可顯著改善OA的炎癥狀態。

3 討論

在本研究中，筆者采取向關節腔內注射Ⅱ型膠原酶的方法來造模，用以加速降解關節軟骨組織中的膠原蛋白，從而造成關節軟骨和滑膜病理損傷，以構建OA模型，相應損傷程度與酶的用量相關。采用Ⅱ型膠原蛋白酶直接注射入關節腔進行造模所需時間較短，酶的用量易控制，OA的病理損傷程度也易于控制，較其他造模方法而言更加簡便［16］。本實驗采用了Masson染色法和天狼猩紅染色法來分析關節軟骨組織中膠原的分布情況（圖3，圖4），結果顯示，OA小鼠關節的膠原分布明顯低于陰性對照組小鼠，表明出現了明顯的關節軟骨損傷，而采用SCC干預可有效改善OA小鼠的關節膠原缺失狀態，從而緩解OA的癥狀。

作為關節軟骨基質的重要組成部分，糖蛋白通過周圍連接蛋白被束縛于軟骨基質中。在正常生理狀態下，關節軟骨中糖蛋白的產生與降解達成一種動態的平衡，這對維持關節組織的新陳代謝和完整性是至關重要的。而在OA關節中，該平衡遭到破壞，糖蛋白的降解速度高于其合成速度，使得軟骨組織產生明顯的缺損。目前，軟骨基質糖蛋白流失已被看作是OA發生的病理標志［17］。在本研究中，筆者采用番紅-O染色的方法來分析關節軟骨組織的糖蛋白分布狀況（圖6），結果顯示，OA小鼠關節軟骨的糖蛋白含量顯著減少，病理缺損明顯，而采用SCC干預可顯著提高糖蛋白含量，有效緩解關節軟骨組織的病理損傷。

在OA的發生發展中，血清中滑膜細胞可產生IL-1β致炎因子，通過IL-1β與腫瘤壞死因子等相互作用，最終將活化NF-κB信號通路，激活炎癥表達通路［18］。同時，IL-1β將刺激軟骨細胞和滑膜細胞產生基質金屬蛋白酶，促進軟骨基質的降解；刺激軟骨細胞和滑膜產生一氧化氮，抑制軟骨細胞增殖，誘導軟骨細胞凋亡［19-21］。而對正常軟骨細胞體外實驗證實，IL-4通過抑制IL-1β誘導軟骨細胞合成基質金屬蛋白酶而起到軟骨保護作用；同時IL-4也參與軟骨細胞應力信號傳導，是該通路中活躍的信號因子，調節軟骨細胞功能和結構的完整性［22-25］。本研究顯示，SCC給藥干預可顯著降低OA小鼠的血清IL-1β水平和提升血清IL-4水平（圖7），表明SCC干預可有效降低OA小鼠的炎癥狀態，也提示SCC對OA的改善作用可能是通過作用于IL-1β或IL-4信號通路而實現。

4 小結

本文研究了鯊魚源硫酸軟骨素及膠原蛋白復方（SCC）對小鼠OA的改善作用。采用向膝關節內腔定量注射Ⅱ型膠原蛋白酶的方式構建OA動物模型，每天口服灌胃給予SCC干預4周。研究表明，SCC可恢復關節軟骨中流失的膠原蛋白，降低IL-1β和上調IL-4的表達水平，從而顯著改善Ⅱ型膠原蛋白酶所致的小鼠膝關節炎癥狀。研究顯示，這種源自鯊魚軟骨的復方具有開發成膳食補充劑的良好前景，為鯊魚軟骨資源的深入開發提供了基礎。