胡蘆巴總皂苷提取工藝的研究

周 彬，李清安，孫代華，張雪元，曹 菁，宋娟娟，褚飛洋

（1. 勁牌持正堂藥業有限公司，湖北 黃石 435000；2. 中藥保健食品質量與安全湖北省重點實驗室，湖北 大冶 435100）

胡蘆巴為豆科植物胡蘆巴的干燥成熟種子，俗稱香豆子、香草子，具有溫腎、祛寒、止痛作用，主要用于腎臟虛冷、小腹冷痛、小腸疝氣、寒濕腳氣等疾病，為藥食兼用植物，國內外一些學者研究發現動物試驗中胡蘆巴具有降血糖的作用[1-2]，能夠降低糖尿病大鼠血糖，引起了人們的關注，研究表明，胡蘆巴降血糖主要功效成分有總皂苷[3-4]、多糖[5]、胡蘆巴堿[6-8]、4 - 羥基異亮氨酸[9-10]等，以總皂苷為目標成分進行提取工藝研究，為胡蘆巴在血糖控制方面的應用提供依據和參考。

1 試劑材料與設備

1.1 材料與試劑

胡蘆巴藥材，湖北正光九資河藥業提供；PT 固相萃取柱，河北津楊提供；人參皂苷Re 標準品（97.4%），食品藥品檢定研究院提供；甲醇、冰醋酸、5%香草醛冰乙酸（香草醛5 g 加冰乙酸溶解并定容至100 mL）、高氯酸（均為分析純），國藥提供；純凈水等。

1.2 儀器

小型粉碎機，上海頂帥產品；TU1901 型紫外分光光度計，北京譜析產品；EYEL4 N-1100 型旋轉蒸發儀，艾朗產品；恒溫水浴鍋，常州國宇產品；AB135-S 型電子天平，梅特勒產品；調速玻璃反應釜，長城科工貿產品。

2 結果與分析

2.1 樣品總皂苷檢測方法及標準曲線繪制

2.1.1 樣品總皂苷檢測方法

參照衛生部2003 版《保健食品檢驗與技術評價規范》中制定的總皂苷檢測方法，藥材粉碎過60 目篩，提取物樣品粉碎過100 目篩，取1 g 藥材粉末或適量提取物置于100 mL 三角瓶中，加50 mL 純水超聲提取30 min，冷卻后以純水恢復原質量，濾紙過濾，取濾液1 mL 上樣已預處理的總皂苷檢測專用PT 固相萃取柱（預處理方法：70%乙醇洗脫25 mL，再以純水洗脫25 mL），先以25 mL 純水洗脫，再以25 mL 70%乙醇洗脫，收集醇洗脫液，于蒸發皿中60 ℃蒸干，加0.4 mL 的5%香草醛冰乙酸溶解蒸發皿中的殘渣、再加1.6 mL 高氯酸顯色，混勻后轉移至10 mL 比色管，塞上管塞，于60 ℃下水浴10 min，取出后迅速冷卻并加入10 mL 的冰乙酸，充分混勻，于波長560 nm 處測定吸光度得總皂苷濃度。2.1.2 總皂苷檢測標準曲線的繪制

精密稱得純度97.4%的人參皂苷Re 對照品15.67 mg 于10 mL 容量瓶，凈含量為15.26 mg，甲醇溶解并定容至刻度，即質量濃度為1.526 mg/mL，分別取40，80，120，160，200，240 μL于10 mL比色管配制成質量濃度5.086 7，10.173 3，15.259 9，20.346 5， 25.433 1，30.519 7 mg/L 的人參總皂苷溶液，于60 ℃水浴蒸干，分別加入0.4 mL 的質量分數5%香草醛冰乙酸溶解殘渣、再加1.6 mL 高氯酸顯色，塞緊管塞，60 ℃下水浴10 min，取出后迅速冷卻并加入10 mL 的冰乙酸，混勻，于波長560 nm 處測定吸光度。以總皂苷含量C 為橫坐標，以吸光度A 為縱坐標繪制標準曲線，得到回歸方程：A=0.025 94C-0.051 93，即C=（A + 0.051 93）÷0.025 94，R2=0.999 92，在5.086 7～30.519 7 mg/L 范圍內線性良好。

總皂苷標準曲線見圖1。

圖1 總皂苷標準曲線

2.1.3 藥材總皂苷檢測

取胡蘆巴藥材適量，萬能粉碎機粉碎，過篩，取過篩粉末1 g 置100 mL 容量瓶中，加100 mL 純水超聲提取30 min，再以水定容至刻度，按2.1.1 中方法檢測皂苷質量分數，測得藥材中總皂苷含量為1.46%，藥材提取后濃縮干燥得干浸膏，得率為21.4%。

2.2 胡蘆巴總皂苷正交提取

2.2.1 提取次數單因素試驗

取4 份20 g 胡蘆巴，設置1，2，3，4 次的提取次數梯度，以體積分數40%乙醇為提取溶劑，提取溫度80 ℃，溶劑倍數10 倍，提取時間2 h，每次進行提取次數單因素試驗，提取后各組不同次數提取液合并、混勻，測定體積，取適量過濾紙，濾液以2.1.1 中方法測定總皂苷含量并計算總皂苷提取率。

胡蘆巴總皂苷提取次數單因素試驗見表1，不同提取次數總皂苷提取率曲線見圖2。

表1 胡蘆巴總皂苷提取次數單因素試驗

由圖2 可知，胡蘆巴提取3 次最佳，但2 次提取與3 次提取結果相差不大，綜合時間及成本考慮，采用2 次提取。

2.2.2 提取乙醇體積分數單因素試驗

分別取20 g 胡蘆巴，設置0，20%，40%，60%，80%的提取乙醇體積分數梯度，以提取溫度80 ℃，10 倍溶劑，提取時間2 h，提取次數2 次進行提取溶液乙醇體積分數單因素試驗，提取后合并各組2 次提取液，混勻，測定體積，取適量提取液過濾紙，濾液以2.1.1 中方法測定總皂苷濃度，并計算總皂苷提取率。

胡蘆巴總皂苷提取乙醇體積分數單因素試驗見表2，不同乙醇體積分數下的總皂苷提取率曲線見圖3。

表2 胡蘆巴總皂苷提取乙醇體積分數單因素試驗

由圖3 可知，隨著乙醇體積分數的升高，總皂苷提取率先升高再降低，40%體積分數時最佳，因此可在正交試驗時設置20%，30%，40%體積分數梯度。

2.2.3 提取溶劑倍數單因素試驗

圖3 不同乙醇體積分數下的總皂苷提取率曲線

取5 份20 g 胡蘆巴，設定8 倍，10 倍，12 倍，14 倍，16 倍的溶劑倍數梯度，以體積分數40%乙醇為提取溶劑，提取溫度80 ℃，提取時間2 h ，提取次數2 次，進行不同溶劑倍數提取的單因素試驗，提取后合并各組2 次提取液并混勻，測定體積，取適量提取液過濾紙，濾液以2.1.1 中方法測定總皂苷濃度并計算總皂苷提取率。

胡蘆巴總皂苷提取溶劑倍數單因素試驗見表3，不同溶劑倍數提取的總皂苷提取率曲線見圖4。

表3 胡蘆巴總皂苷提取溶劑倍數單因素試驗

圖4 不同溶劑倍數提取的總皂苷提取率曲線

由圖4 可知，隨著溶劑倍數的增加，總皂苷的提取率先升高，但達到一定倍數后，繼續升高溶劑倍數，總皂苷得率反而降低，因此溶劑倍數并非越大越好，溶劑倍數過大造成提取后濃縮干燥的時間能耗成本增加及一定的總皂苷損失，根據試驗結果，正交試驗時可設定10 倍，12 倍，14 倍的溶劑倍數。

2.2.4 提取時間單因素試驗

取5 份20 g 胡蘆巴，設定1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h 的提取時間梯度，以30%乙醇為提取溶劑，提取溫度80 ℃，提取次數2 次，進行不同提取時間的單因素試驗，提取后合并各組的2 次提取液并混勻，測定體積，取適量提取液過濾紙，濾液以2.1.1 中方法測定總皂苷濃度并計算總皂苷提取率。

胡蘆巴總皂苷提取時間單因素試驗見表4，不同提取時間下的總皂苷提取率曲線見圖5。

由圖5 可知，隨著提取時間的升高，總皂苷提取率逐步上升，在2.5 h 到達最高，3.0 h 提取2 次時提取率出現下降，正交試驗時可設置2.0，2.5，3.0 h 的提取時間梯度。

表4 胡蘆巴總皂苷提取時間單因素試驗

圖5 不同提取時間下的總皂苷提取率曲線

2.2.5 提取溫度單因素試驗

取5 份20 g胡蘆巴，設定45，55，65，75，85 ℃的提取溫度梯度，以30%乙醇為提取溶劑，12 倍溶劑，提取時間2 h，提取次數2 次，進行提取溫度的單因素試驗，提取后合并各組的2 次提取液并混勻，測定體積，取適量提取液過濾紙，濾液以2.1.1 方法測定總皂苷濃度并計算總皂苷提取率。

不同溫度提取胡蘆巴總皂苷的單因素試驗見表5，不同溫度提取的總皂苷提取率曲線見圖6。

表5 不同溫度提取胡蘆巴總皂苷的單因素試驗

圖6 不同溫度提取的總皂苷提取率曲線

由圖6 可知，提取溫度較低時總皂苷提取率非常低，隨著提取溫度的升高，總皂苷提取率在75 ℃時達到最大，因此正交試驗時可設置65，75，85 ℃的提取溫度梯度。

2.3 胡蘆巴總皂苷的正交提取

2.3.1 正交提取

根據單因素試驗結果，取9 份20 g 胡蘆巴，設置葫20%，30%，40%的乙醇體積分數梯度；10 倍，12 倍，14 倍的溶劑倍數梯度；2.0，2.5，3.0 h 的提取時間梯度；65，75，85 ℃的提取溫度梯度進行正交試驗，考查胡蘆巴總皂苷的最佳提取工藝。

胡蘆巴總皂苷正交試驗因素見表6，胡蘆巴總皂苷正交提取試驗結果見表7，胡蘆巴總皂苷提取率因素效應曲線見圖7。

表6 胡蘆巴總皂苷正交試驗因素

表7 胡蘆巴總皂苷正交提取試驗結果

圖7 胡蘆巴總皂苷提取率因素效應曲線

由正交試驗結果方差分析可知，胡蘆巴總皂苷提取因素影響大小依次為提取時間（C） ＞乙醇體積分數（A） ＞提取溫度（D） ＞溶劑倍數（B），根據圖7 的效應曲線預測胡蘆巴總皂苷最佳提取工藝為A2B2C2D2，即乙醇體積分數30%，溶劑倍數12 倍，提取溫度75 ℃，提取時間2.5 h，提取次數2 次。

胡蘆巴總皂苷正交提取試驗方差分析見表8。

表8 胡蘆巴總皂苷正交提取試驗方差分析

2.3.2 正交試驗結果驗證

分別取20 g 胡蘆巴，以正交試驗預測的最佳提取工藝為以體積分數30%乙醇，12 倍體積于75 ℃下提取2 次，每次2.5 h 為提取條件，設置3 組進行提取，總皂苷提取率分別為77.14%，77.55%，76.53%，均值為77.07%，總皂苷得率均值為1.13%，RSD 為0.67%（n=3），結果波動較小，且優于正交試驗各組結果，說明該工藝穩定可行。

3 結論

通過試驗發現，胡蘆巴總皂苷提取的因素影響大小依次為提取時間（C） ＞乙醇體積分數（A） ＞提取溫度（D） ＞溶劑倍數（B），根據圖7 的效應曲線預測胡蘆巴總皂苷提取的最佳工藝為A2B2C2D2，即乙醇體積分數30%，溶劑倍數12 倍，提取溫度75 ℃，提取時間2.5 h，提取次數2 次。對該工藝進行的3 組驗證提取結果顯示，工藝穩定可靠，可以有效從胡蘆巴中提取總皂苷，為胡蘆巴的應用提供參考。