茭白葉黃酮類物質的提取工藝優(yōu)化及抗氧化研究

何莉萍，張澤英，黃愛妮，李 麗，高 維

（武昌工學院城市建設學院，湖北武漢 430065）

茭白葉是我國第二大水生蔬菜茭白的葉，常被作為廢棄物丟掉。茭白葉生物質量占茭白植株總質量的50%～70%，每667 m2茭白田每年產(chǎn)生的茭白鮮秸稈達5 000 kg 以上[1]。茭白產(chǎn)季，大量茭白葉腐爛在田間地頭，造成資源的極大浪費，且環(huán)境污染嚴重[2]。茭白葉中富含一定黃酮類物質[3]。目前，提取黃酮類物質的方法主要有醇提法、微波提取法和超聲波提取法等[4-5]。其中，以超聲波提取法效果最佳。在現(xiàn)有文獻中，僅有一篇論文利用微波法提取茭白葉黃酮[3]。以茭白葉為原料，利用超聲波法提取茭白葉中的黃酮類物質，以期為茭白的綜合價值開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茭白葉，武漢市中百倉儲超市中廢棄的茭白葉；無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉，均為分析純；蘆丁標準品，合肥博美生物公司提供；DPPH分析純，安徽酷爾生物工程有限公司提供。

茭白葉的處理方法：將新鮮茭白葉洗凈切碎，放入60 ℃恒溫干燥箱中烘干至茭白葉內(nèi)部無明顯水分，利用植物粉碎機粉碎后過40 目篩，備用。

1.2 儀器與設備

FZ102 型微型植物粉碎機，上海科恒實業(yè)發(fā)展有限公司產(chǎn)品；GZX-9070M型電熱恒溫數(shù)顯鼓風烘箱，上海博訊有限公司產(chǎn)品；UV-100 型紫外分光光度計，上美析儀器有限公司產(chǎn)品；JA1001 型分析天平，奧豪斯儀器有限公司產(chǎn)品；HH-2 型恒溫水浴鍋，國華電器有限公司產(chǎn)品；KQ500DB 型超聲波清洗器，昆山舒美超聲儀器有限公司產(chǎn)品；LD5-2A 型臺式低速離心機，北京京立離心機有限公司產(chǎn)品；LPF-800T 型粉碎機，永康市紅太陽機電有限公司產(chǎn)品。

1.3 黃酮標準曲線的繪制

稱取蘆丁純品0.01 g，再取體積分數(shù)80%乙醇溶液50 mL，配置得到質量濃度0.2 mg/mL 的蘆丁標準溶液。以1 mL 為單位，取5 種不同分量的溶液放在具塞刻度試管中，加入質量分數(shù)5%亞硝酸鈉0.3 mL，靜置6 min，再加質量分數(shù)10%硝酸鋁0.3 mL，靜置6 min，最后加入質量分數(shù)4%氫氧化鈉4.0 mL 后加水至刻度，搖晃均勻，靜置12 min 后于波長510 nm處測其黃酮含量，將波長510 nm 處測得的吸光度（A） 作為縱坐標，蘆丁標準液質量濃度（C） 作為橫坐標做回歸曲線，得出回歸方程。

1.4 超聲波法提取茭白葉黃酮單因素試驗

分別以料液比、乙醇體積分數(shù)、提取時間、提取溫度及超聲功率為單因素，在其中一個因素進行試驗時，其他因素條件均為定值（料液比1∶30，乙醇體積分數(shù)60%，提取時間20 min，提取溫度50 ℃，超聲功率450 W）。

單因素試驗方法：準確稱取5 份1.00 g 茭白葉粉末，將其分別放置在具塞比色管中，按照料液比（m/V） （1∶20，1∶25，1∶30，1∶35，1∶40），加入體積分數(shù)為（40%，50%，60%，70%，80%）的乙醇溶液，置于（30，40，50，60，70 ℃）、功率為（150，300，450，600，750 W） 的超聲波清洗器中（10，15，20，25，30 min） 后，在轉速4 200 r/min離心10 min，取上清液，將樣液稀釋至吸光度為0.400～0.700，于波長510 nm 條件下利用分光光度計比色，計算其黃酮類物質的含量。

1.5 超聲波法提取茭白葉黃酮正交試驗設計

以黃酮類物質的提取率為標準設計正交試驗，從5 個單因素中選出影響較大的4 個單因素，設計正交試驗。

超聲波法提取茭白葉總黃酮的正交試驗因素與水平設計見表1。

表1 超聲波法提取茭白葉總黃酮的正交試驗因素與水平設計

1.6 茭白葉黃酮粗提物對油脂氧化的抑制試驗

將茭白葉黃酮粗提物按0.05%（質量比） 的比例添加到大豆油中，并放置在65 ℃的烘箱中，測定過氧化值，定期觀察其抗氧化程度。

1.7 茭白葉黃酮提取率的計算

用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 體系絡合化學吸收法測定黃酮[6]。按如下公式計算茭白黃酮提取率：

式中：Y——黃酮類物質的含量，%；

C——根據(jù)標準曲線求得的黃酮類物質的質量濃度，mg/mL；

N——稀釋倍數(shù)；

V——定容體積，mL；

W——茭白的質量，mg。

2 結果與分析

2.1 蘆丁標準曲線的繪制

蘆丁標準曲線的繪制見圖1。

圖1 蘆丁標準曲線的繪制

由圖1 可知，得到回歸曲線方程為：

Y=0.507 6X+0.010 3，R2=0.998 3.

式中：Y——測定樣品的吸光度；

X——蘆丁質量濃度，mg/mL。

2.2 不同料液比對茭白葉黃酮提取率的影響

不同料液比對茭白葉黃酮提取率的影響見圖2。

圖2 不同料液比對茭白葉黃酮提取率的影響

由圖2 可知，隨著料液比增加，茭白葉黃酮類物質提取率不斷升高，料液比在1∶30 后，上升幅度不大。當料液比較低時，溶劑量越大，茭白葉黃酮溶出量越高，這是由于一定量溶劑有利于將茭白葉黃酮溶出，當料液比達到1∶30 后，隨著料液比的提高，茭白葉黃酮提取效果提高的不夠明顯，這可能是由于乙醇溶液對茭白葉黃酮的提取達到了飽和，當繼續(xù)增大乙醇體積分數(shù)時，其他醇溶性雜質被溶出[6]，從而導致黃酮類化合物的減少，考慮到提取工藝成本，選擇正交設計料液比為1∶25～1∶35。

2.3 不同乙醇體積分數(shù)對茭白葉黃酮提取率的影響

不同乙醇體積分數(shù)對茭白葉黃酮提取率的影響見圖3。

由圖3 可知，茭白葉黃酮提取率呈現(xiàn)先上升、后下降的趨勢。較高的乙醇體積分數(shù)加速黃酮類物質的溶出，當乙醇體積分數(shù)大于60%后，可能存在部分醇溶性雜質，與黃酮類化合物競爭，從而使黃酮類化合物溶出量減少。因此，選擇正交設計的乙醇體積分數(shù)為50%～70%。

圖3 不同乙醇體積分數(shù)對茭白葉黃酮提取率的影響

2.4 不同提取溫度對茭白葉黃酮提取率的影響

不同提取溫度對茭白葉黃酮提取率的影響見圖4。

圖4 不同提取溫度對茭白葉黃酮提取率的影響

由圖4 可知，提取溫度為50 ℃時，達到最佳提取率。溫度適當升高，分子運動加劇，提取率升高，但溫度過高后，極少量黃酮類物質不穩(wěn)定，導致提取率稍有下降。因此，選擇最優(yōu)提取溫度為50 ℃。

2.5 不同提取時間對茭白葉黃酮提取率的影響

不同提取時間對茭白葉黃酮提取率的影響見圖5。

圖5 不同提取時間對茭白葉黃酮提取率的影響

由圖5 可知，提取時間越長，溶劑能夠充分滲透至茭白葉組織中，將黃酮類物質充分溶解，黃酮提取率增加，在20 min 時達到最高點，但繼續(xù)超聲波提取后，黃酮提取率稍稍下降，但下降趨勢不明顯，這主要是由于黃酮類物質在長時間超聲波條件下，可能發(fā)生降解。因此，選擇正交試驗的提取時間為15～25 min。

2.6 不同超聲功率對茭白葉黃酮提取率的影響

不同超聲功率對茭白葉黃酮提取率的影響見圖6。

圖6 不同超聲功率對茭白葉黃酮提取率的影響

由圖6 可知，隨著超聲功率增加，黃酮提取率提高，在450 W 處達到最高值，之后有大幅度下降。這主要是由于超聲波在液體中產(chǎn)生“空穴作用”，使分子運動加劇，溶質更易擴散，植物細胞及細胞膜結構破壞，有助于黃酮類物質的釋放與溶出，提取時間縮短。隨著超聲功率的增加，溶劑將茭白葉中的其他醇溶性雜質溶出，茭白黃酮類物質溶出量減少，且功率較高時，增加了黃酮類物質降解的機率。因此，超聲功率為300～600 W 時較適宜。

2.7 超聲波法提取茭白葉黃酮類物質正交試驗設計

超聲波法提取茭白葉總黃酮的正交試驗結果見表2。

表2 超聲波法提取茭白葉總黃酮的正交試驗結果

由表2 可知，茭白葉黃酮含量影響因素的主次順序依次為乙醇體積分數(shù)（A） ＞料液比（B） ＞超聲功率（D） ＞超聲時間（C）。最優(yōu)工藝條件為A2B2C3D2，即乙醇體積分數(shù)60%，料液比1∶30，超聲時間25 min，超聲功率450 W，在此條件下進行驗證試驗，得到茭白葉黃酮的得率為3.675%。

2.8 茭白葉黃酮粗提物對油脂氧化的抑制試驗

不同質量分數(shù)茭白葉黃酮粗提物對油脂氧化的抑制作用比較見圖7。

由圖7 可知，茭白葉黃酮粗提物對油脂具有較好的抗氧化作用，同質量分數(shù)的茭白葉黃酮與維C的抗氧化作用相當。

圖7 不同質量分數(shù)茭白葉黃酮粗提物對油脂氧化的抑制作用比較

3 結論

超聲波法提取茭白葉黃酮的最優(yōu)工藝條件為乙醇體積分數(shù)60%，料液比1∶30，超聲時間25 min，超聲溫度50 ℃，超聲功率450 W。茭白葉黃酮粗提物對油脂有良好的抗氧化能力，與同含量的維C 抗氧化效果相當。茭白葉黃酮是天然的抗氧化劑，其安全性好，是一種非常有前途的天然抗氧化劑。