類風濕關(guān)節(jié)炎患者MTHFR C677T基因多態(tài)性與甲氨蝶呤藥物不良反應(yīng)的關(guān)系

王丹,劉靜,陳勇，馮丹，姜蓉瓊，楊桂釗，袁國華

川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院風濕免疫研究所,四川南充637000

類風濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一種以侵蝕性關(guān)節(jié)炎為主要表現(xiàn)的全身性自身免疫性疾病。目前RA的治療藥物主要包括非甾體抗炎藥(NSAIDs)、改善病情抗風濕藥(DMARDs)、糖皮質(zhì)激素、生物制劑及JAK抑制劑等。在DMARDs中，甲氨蝶呤(MTX)為RA臨床一線用藥，常作為RA的起始治療藥物，尤其是對有侵襲性證據(jù)的RA患者，其可有效控制患者骨質(zhì)破壞進展。近年來，許多針對RA的生物制劑得到廣泛應(yīng)用，但在無用藥禁忌情況下，MTX為RA的首選藥物，其可單獨用藥或與其他DMARDs聯(lián)合用藥[1-3]。雖然已知甲氨蝶呤具有最佳的成本效益和療效/毒性比率，但其毒性作用仍不容忽視，多數(shù)患者由于甲氨蝶呤相關(guān)藥物不良反應(yīng)(ADRs)的發(fā)生而中斷長期治療[4]。亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)為葉酸代謝途徑中重要的轉(zhuǎn)化酶，MTHFR在MTX作用機制途徑(包括葉酸途徑、蛋氨酸途徑、嘌呤及嘧啶從頭合成途徑等[5])中意義重大。目前已有多項研究表明，MTX治療結(jié)果與MTHFRC677T基因多態(tài)性有關(guān)[6-9]。為進一步探討RA患者MTHFRC677T基因多態(tài)性與MTX相關(guān)ADRs的關(guān)系，本研究采用TaqMan熒光PCR技術(shù)檢測MTHFR[677C>T (rs1801133)]的單核苷酸多態(tài)性(SNP)，并回顧患者使用MTX期間出現(xiàn)的相關(guān)ADRs，分析MTHFRC677T基因多態(tài)性與MTX不良反應(yīng)的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018年12月—2019年12月于川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院風濕免疫科就診的RA患者178例，其中男24例、女154例，年齡18～75歲，患者均連續(xù)接受過MTX治療，MTX劑量為每周5～20 mg，治療持續(xù)至少4個月。入選患者均符合美國風濕病學會(ACR)和歐洲風濕病聯(lián)盟(EULAR)2010年修訂的RA分類標準，并排除感染、腫瘤、妊娠或母乳、其他慢性疾病及肝腎功能不全等因素。本研究遵循人體受試者道德倫理學標準，研究方案得到川北醫(yī)學院倫理委員會批準，所有受試者簽署知情同意書。

1.2 DNA提取 空腹抽取受試者外周靜脈血2 mL置于EDTA-K2抗凝管中，取1 mL全血樣本，用DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取DNA，提取出的DNA樣本使用Merinton儀器公司SMA4000微量分光光度計(Merinton Instrument, Inc)測量樣本濃度及純度，要求A260/A280在1.8～2.0，濃度大于20 ng/mL，測量完成的樣本保存于-80 ℃冰箱，用于后續(xù)實驗。

1.3 等位基因分型 用TaqMan熒光PCR方法檢測MTHFR[677C>T (rs1801133)]的SNP。用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計PCR引物及TaqMan-MGB探針，PCR引物序列：正向引物5′-GCTGACCTGAAGCACTTGAAG-3′，反向引物5′-GAATGTGTCAGCCTCAAAGAAA-3′；TaqMan探針序列：FAM-TGAAATCGGCTCCC-MGB，VIC-TGAAATCGACTCCCG-MGB，C型為FAM標記，T型為VIC標記，MGB為小溝結(jié)合物。DNA樣本稀釋10倍后作為模板檢測。PCR反應(yīng)體系總體積為10 μL，2×TaqMan Fast qPCR Master Mix 5 μL，正向引物0.25 μL，反向引物0.25 μL，兩種熒光探針各0.2 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 3.1 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃反應(yīng)3 min、94 ℃反應(yīng)5 s、60 ℃反應(yīng)30 s。PCR反應(yīng)在LightCycler480型熒光定量PCR儀(Rotkreuz, Switzerland)上進行，反應(yīng)結(jié)果表現(xiàn)為不同基因型發(fā)出不同的熒光：C型為FAM標記，藍色熒光，表現(xiàn)為X型；T型為VIC標記，綠色熒光，表現(xiàn)Y型；雜合CT型，混合型，為紅色熒光，表現(xiàn)為XY型。

1.4 不良反應(yīng)觀察 統(tǒng)計受試者MTX應(yīng)用期間出現(xiàn)的MTX相關(guān)ADRs，包括胃腸黏膜反應(yīng)(如口腔潰瘍、反酸、惡心、嘔吐、胃痛、胃潰瘍、腹痛等)、血液系統(tǒng)損害(如白細胞減少、血小板減少等)、肝腎功能損害(轉(zhuǎn)氨酶、肌酐、尿素氮等異常)、生殖系統(tǒng)(如月經(jīng)異常)及其他(如頭暈、脫發(fā)、口唇皰疹、肺間質(zhì)病變等)。其中，血液系統(tǒng)損害定義為白細胞計數(shù)<3.5×109/L[(3.5～9.5)×109/L]和/或血小板計數(shù)<100×109/L[(100～300)×109/L]；肝功損害表現(xiàn)為轉(zhuǎn)氨酶≥3倍正常值上限；腎功能損害表現(xiàn)為血尿素氮、肌酐大于正常值上限，尿常規(guī)出現(xiàn)隱血、尿蛋白，并排除生理及食源性因素影響。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件。采用Hardy-Weinberg平衡法檢測基因型間等位基因頻率分布是否符合遺傳平衡法則。不良反應(yīng)的發(fā)生與各可能影響因素的關(guān)系研究采用Logistic回歸分析。各基因型ADRs發(fā)生頻率組間比較采用χ2檢驗，非正態(tài)分布的計量資料組間比較采用非參數(shù)秩和檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 MTX相關(guān)ADRs的發(fā)生率 178例受試者中，應(yīng)用MTX治療期間出現(xiàn)ADRs71例，包括胃腸道反應(yīng)31例、血液系統(tǒng)毒性35例、肝毒性7例、腎毒性4例、生殖系統(tǒng)毒性6例、其他(脫發(fā)、頭暈、肺間質(zhì)病變等)7例，MTX相關(guān)ADRs的發(fā)生率為39.9%。31例發(fā)生胃腸道反應(yīng)患者中，同時伴有血液系統(tǒng)毒性7例、肝毒性2例、生殖系統(tǒng)毒性1例、其他(脫發(fā)、頭暈、肺間質(zhì)病變等)3例。35例發(fā)生血液系統(tǒng)毒性患者中，同時伴有胃腸道反應(yīng)7例、肝毒性1例、腎毒性1例、生殖系統(tǒng)毒性2例、其他(脫發(fā)、頭暈、肺間質(zhì)病變等)3例。

2.2 基因分型結(jié)果 TaqMan熒光PCR結(jié)果顯示，178例受試者基因型分布：CC基因型71例，CT基因型76例，TT基因型31例。根據(jù)Hardy-Weinberg平衡檢驗方法，對各基因型等位基因頻率進行χ2檢驗，結(jié)果提示P>0.05，等位基因分布比較差異無統(tǒng)計學意義，符合遺傳平衡定律。

2.3 ADRs的影響因素分析 使用二元Logistic回歸分析方法分析患者性別、年齡、用藥時間、基因型因素與患者是否發(fā)生ADRs的相關(guān)性。結(jié)果提示患者的基因型與其發(fā)生ADRs結(jié)果有關(guān)；TT基因型與CT基因型比較差異有統(tǒng)計學意義(OR=3.032，95%CI：1.259～7.298，P<0.05)，TT基因型與CC基因型比較差異無統(tǒng)計學意義(OR=1.611，95%CI：0.683～3.801，P>0.05)，CT基因型與CC基因型比較差異無統(tǒng)計學意義(OR=0.531，95%CI：0.265～1.064，P>0.05)；TT基因型較CT基因型患者更易發(fā)生ADRs。性別、年齡及用藥時間對是否發(fā)生ADRs的影響差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。

2.4 基因多態(tài)性與ADRs的關(guān)系 178例受試者中71例發(fā)生ADRs，其中CC基因型31例、CT基因型23例、TT基因型17例。在各個基因型患者中，TT基因型ADRs發(fā)生率最高，約54.8%，其次CC基因型(43.7%)，CT基因型最低(30.3%)。三組基因型間ADRs發(fā)生率比較差異有統(tǒng)計學意義(χ2=6.248，P<0.05)。進一步分析各基因型患者不同類型ADRs的發(fā)生差異。CC基因型中，胃腸道反應(yīng)15例、血液系統(tǒng)毒性16例、肝毒性2例、腎毒性1例，生殖系統(tǒng)毒性4例，其他1例；CT基因型中，胃腸道反應(yīng)11例、血液系統(tǒng)毒性12例、肝毒性1例、腎毒性1例、生殖系統(tǒng)毒性1例、其他2例；TT基因型中，胃腸道反應(yīng)5例、血液系統(tǒng)毒性7例、肝毒性4例、腎毒性2例、生殖系統(tǒng)毒性1例、其他3例。三種基因型不同ADRs發(fā)生頻率比較差異無統(tǒng)計學意義(χ2=10.938，P>0.05)。此外，在監(jiān)測RA患者血常規(guī)指標時，發(fā)現(xiàn)患者在應(yīng)用MTX后，后期較初期平均紅細胞體積(MCV)有增高趨勢，有35例患者后期出現(xiàn)MCV值高于正常上限，其中CC基因型14例、CT基因型13例、TT基因型8例，基因型間頻率比較差異無統(tǒng)計學意義(χ2=1.056，P>0.05)。對各基因型MCV變化值(ΔMCV)進行統(tǒng)計，使用非參數(shù)秩和檢驗分析方法，結(jié)果顯示三種基因型MCV變化值差異無統(tǒng)計學意義(H=0.365，P>0.05)

3 討論

RA是一種較常見的致殘性關(guān)節(jié)炎,未正確治療的RA可導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形和功能喪失。早期、合理地選擇藥物治療，可控制RA患者的病情進展，改善患者的預(yù)后及生活質(zhì)量。MTX為治療RA的常用藥物之一，多作為RA的起始治療藥物，對控制患者疾病進展療效顯著。此外，對合并關(guān)節(jié)外表現(xiàn)的RA患者，特別是血管炎，也可推薦使用MTX。MTX的作用機制包括MTX膜轉(zhuǎn)運途徑及細胞內(nèi)途徑，其中細胞內(nèi)途徑又包括多聚谷氨酸途徑、葉酸途徑、蛋氨酸途徑、腺苷途徑和嘌呤、嘧啶從頭合成途徑[5]。

細胞內(nèi)葉酸代謝處于嘧啶、嘌呤從頭合成途徑和蛋氨酸合成途徑的分支上，且10-甲基四氫葉酸(10-MTHF)為嘌呤合成提供碳基，5,10-MTHF為胸腺嘧啶合成提供碳基，5-MTHF為蛋氨酸合成提供甲基[10]。由此可見，葉酸代謝在MTX細胞內(nèi)途徑通路中作用顯著。MTHFR作為葉酸代謝的關(guān)鍵酶，其功能活性影響血漿中四氫葉酸水平。由此可推測，MTHFR酶活性與MTX作用可能相關(guān)。

多種轉(zhuǎn)化酶參與MTX的作用途徑，如二氫葉酸還原酶(DHFR)、亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)、蛋氨酸合酶(MTR)、胸苷酸合酶(TYMS)、氨基咪唑羧酰胺核糖核苷酸轉(zhuǎn)化酶(ATIC)等[5]。研究發(fā)現(xiàn)，MTX及其細胞內(nèi)穩(wěn)定形態(tài)—甲氨蝶呤聚谷氨酸(MTXPG)，對DHFR、MTR、TYMS、ATIC有直接抑制作用[11-12]，使細胞內(nèi)多種途徑受到影響，從而抑制核酸的合成、影響氨基酸代謝，致使各種免疫細胞的增殖、分化受抑，從而發(fā)揮免疫抑制作用。目前雖無研究發(fā)現(xiàn)MTX對MTHFR酶活性有直接抑制作用，但有研究觀察到MTHFR基因多態(tài)性與MTX治療結(jié)果相關(guān)[13-15]。

雖然有關(guān)基因多態(tài)性與MTX療效的研究有很多，但因地域、納入條件、樣本大小等各方面差異，這些研究結(jié)果參差不齊[7-8,15]。因MTX作用機制與葉酸代謝的密切關(guān)系，MTHFRC677T基因位點多態(tài)性成為研究熱點。且部分學者針對MTX治療結(jié)果與MTHFR基因多態(tài)性關(guān)系的研究進行Meta分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MTHFR C677T基因多態(tài)性與MTX毒性有關(guān)，MTHFR A1298C基因多態(tài)性與MTX療效有關(guān)[9,13-14]。

本研究發(fā)現(xiàn)，178例受試者中71例在應(yīng)用MTX期間出現(xiàn)ADRs，其中胃腸道反應(yīng)31例、血液系統(tǒng)毒性35例、肝毒性7例、腎毒性4例、生殖系統(tǒng)毒性6例、其他7例。TT基因型患者MTX的ADRs發(fā)生率最高(54.8%)，CC基因型其次(43.7%)，CT基因型最低(30.3%)；三種基因型ADRs的發(fā)生率比較差異有統(tǒng)計學意義。但在各個基因型間，MTX不同類型ADRs的發(fā)生頻率比較差異無統(tǒng)計學意義。

在TT基因型個體中，因MTHFR基因677位點C>T突變使丙氨酸被纈氨酸取代，導(dǎo)致MTHFR酶活性降低，從而影響葉酸循環(huán)代謝，進而影響MTX相關(guān)作用途徑，這可能是TT基因型患者更易出現(xiàn)MTX毒性的原因。

在MTX應(yīng)用期間，隨訪監(jiān)測患者血常規(guī)指標時發(fā)現(xiàn)，后期MCV較初期有明顯增高趨勢，但這種改變在各基因型的表現(xiàn)差異無統(tǒng)計學意義，這與MTX的抗葉酸合成代謝有關(guān)，MTX使DNA、蛋白質(zhì)的合成受阻，影響細胞核的增殖。

因本研究納入患者多為MTX與其他DMARDs聯(lián)用，不易評估MTX的療效，所以本研究僅探討了基因多態(tài)性與MTX相關(guān)ADRs的關(guān)系，但未分析藥物療效與其相關(guān)性。此外，MTX治療結(jié)果與基因多態(tài)性關(guān)系研究可能受到MTX與其他DMARDs聯(lián)用的影響，進一步研究應(yīng)優(yōu)化實驗方案，盡可能選擇單用MTX控制病情的受試者，盡全面地檢測MTX途徑相關(guān)基因多態(tài)性，從而明確基因多態(tài)性與MTX治療結(jié)果的關(guān)系。結(jié)合患者的藥物相關(guān)基因分型結(jié)果，有助于風濕科臨床醫(yī)師制定患者的合理有效治療方案，為RA患者提供個體化治療。