VDR基因多態性與兒童慢性乙型肝炎的臨床相關性分析*

黃彩芝，張 聰，唐 蓮，莫麗亞

湖南省兒童醫院：1.檢驗中心；2.肝病中心，湖南長沙 410007

乙型肝炎病毒(HBV)感染仍然是全球性的重大公共衛生問題，每年約有一百萬人死于HBV感染[1]。HBV感染后可導致慢性乙型肝炎(CHB)、肝纖維化、肝硬化及肝細胞癌，兒童感染HBV后更容易發展為慢性感染，其中新生兒乙型肝炎慢性化率為80%～90%、小于6歲兒童乙型肝炎慢性化率為25%～30%，而成人乙型肝炎慢性化率不超過5%[2]。人類感染HBV的轉歸與病毒本身、環境、宿主免疫狀態和遺傳易感性等多種因素有關。有研究表明，維生素D受體(VDR)基因單核苷酸多態性(SNPs)與HBV宿主遺傳易感性，HBV感染后的免疫調節、治療反應、疾病進程及臨床結局等密切相關[3-6]，但關于VDR基因SNPs與兒童CHB關系的相關報道較少。本研究通過觀察CHB患兒VDR基因位點[BsmI(rs1544410)、ApaI(rs7975232)、TaqI(rs731236)、FokI(rs2228570)]的基因型和等位基因頻率分布，初步探討VDR基因SNPs與兒童CHB的遺傳易感性、HBV基因型、肝臟病變嚴重程度及血清25羥維生素D[25(OH)D]水平的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016-2019年夏秋季節(每年5—10月)就診于本院肝病中心的CHB患兒189例作為CHB組，其中男124例，女65例；年齡[61.00(37.50～97.50)]個月。納入標準：(1)年齡為1個月至14歲；(2)CHB診斷符合中華醫學會感染病學分會和肝病學分會制訂的《慢性乙型肝炎防治指南(2019年版)》[7]診斷標準。排除標準：(1)合并其他肝臟疾病、感染性疾病、惡性腫瘤、自身免疫性疾病、內分泌疾病、血液系統疾病、先天性免疫功能異常等；(2)入院前4周內服用維生素D制劑或免疫調節劑。

采用組織病理活檢的方法衡量肝臟炎癥活動度和纖維化程度[8]，根據肝臟病變嚴重程度將CHB患兒分為輕度組和中度組，根據HBV基因型將CHB患兒分為HBV B型組和HBV C型組。另選擇同期在本院兒童保健所體檢的健康兒童56例作為對照組，其中男36例，女20例；年齡[59.50(32.25～95.25)]個月。CHB組與對照組年齡(Z=0.648，P=0.517)與性別比較(χ2=0.033，P=0.855)，差異均無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究獲得本院倫理委員會批準，所有入選兒童均征得監護人知情同意。

1.2方法

1.2.1標本采集和處理 采集CHB組和對照組兒童空腹靜脈血3～4 mL，其中1 mL使用乙二胺四乙酸抗凝后用于DNA提取，2～3 mL未抗凝血分離血清用于HBV基因分型及25(OH)D水平檢測。

1.2.2DNA提取 采用DNA提取試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司)提取乙二胺四乙酸抗凝血液中的DNA，使用紫外分光光度計測定DNA濃度及純度，置于-20 ℃保存備用。

1.2.3VDR基因SNPs檢測 采用單堿基延伸技術通過多重PCR反應體系檢測VDR基因位點BsmI(rs1544410)、ApaI(rs7975232)、TaqI(rs731236)、FokI(rs2228570)的多態性。PCR擴增儀為美國ABI公司提供的ABI Veriti DX擴增儀。BsmI位點的上游引物：TCT GAG GAA CTA GAT AAG CAG，下游引物：CAG GAA TGT TGA GCC CAG TT；ApaI位點的上游引物：GGA TAG AGA AGA AGG CAC AG，下游引物：CGG TCA GCA GTC ATA GAG G； TaqI位點的上游引物：GCT CCT GTG CCT TCT TCT C，下游引物：GAT GTA CGT CTG CAG TGT G；FokI位點的上游引物：GGT GGC ACC AAG GAT G，下游引物：CAA AGT CTC CAG GGT CAG G。PCR擴增條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共45個循環；72 ℃再延伸5 min。PCR產物純化后行SNaPshot PCR擴增，擴增條件：96 ℃預變性10 s，96 ℃變性10 s，50 ℃退火5 s，60 ℃延伸30 s，25個循環；最后4 ℃恒溫。SNaPshot PCR產物純化后經毛細管電泳，利用美國ABI公司提供的3500Dx基因測序儀完成位點測序，分析軟件為GeneMapper 5.0。

1.2.4HBV基因分型 采用實時熒光定量PCR的方法，由金域醫學檢驗所完成CHB患兒的HBV基因分型。

1.2.5血清25(OH)D水平檢測 采用化學發光法，儀器和試劑為美國西門子ADVIA Centaur XP全自動化學發光免疫分析儀及配套試劑。

1.3統計學處理 使用SPSS18.0軟件對數據進行統計學分析。非正態分布的計量資料以中位數和四分位數[M(P25，P75)]表示，兩組間比較采用Mann-WhitneyU非參數秩和檢驗，多組間比較采用Kruskal-WallisH非參數秩和檢驗；對照組進行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗。計數資料以例數和百分率表示，采用χ2檢驗對組間基因型及等位基因頻率進行比較，以比值比(OR)和95%置信區間(CI)表示暴露于某個基因型或等位基因后發生CHB或感染某種HBV基因型或較嚴重肝臟病變的危險性。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1研究對象一般情況 CHB患兒中有139例進行了HBV基因分型，其中HBV B型組118例，HBV C型組21例；120例CHB患兒行B超引導下肝臟穿刺組織病理活檢，經檢查，肝臟炎癥活動度情況為G1級53例、G2級25例、G3級42例；纖維化程度分別為S0期24例、S1期73例、S2期12例、S3期9例、S4期2例；其中78例患兒經組織病理活檢診斷為輕度CHB(輕度組)，42例患兒經組織病理活檢診斷為中度CHB(中度組)。

2.2CHB組與對照組VDR基因位點基因型與等位基因頻率分布 經Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗，對照組兒童VDR基因 BsmI、ApaI、TaqI、FokI 4個位點基因型頻率符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律(χ2=0.077、2.900、0.019、2.357，均P>0.05)，表明標本選取具有群體代表性。

位于VDR基因ApaI位點的基因型在CHB組和對照組間的頻率分布比較，差異有統計學意義(P<0.05)，CHB組的AC基因型(43.90%)頻率分布高于對照組(26.8%)，提示與ApaI CC基因型比較，AC基因型可能增加兒童HBV感染的風險(OR=2.213，95%CI1.130～4.335)。而BsmI、TaqI和FokI 3個位點的基因型在CHB組和對照組中的頻率分布比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。VDR 基因BsmI、ApaI、TaqI、FokI 4個位點的等位基因在CHB組和對照組中的頻率分布比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.3CHB患兒輕度組與中度組VDR基因位點基因型與等位基因頻率分布 VDR基因 BsmI、ApaI、TaqI、FokI 4個位點的基因型和等位基因頻率分布在輕度組和中度組CHB患兒中比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。見表2。

2.4CHB患兒HBV B型組與HBV C型組VDR基因位點基因型與等位基因頻率分布 HBV B型組與HBV C型組CHB患兒中，VDR基因BsmI、ApaI、TaqI、FokI 4個位點的基因型和等位基因頻率分布比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表1 CHB組與對照組VDR基因位點基因型與等位基因頻率分布[n(%)]

表2 CHB患兒輕度組與中度組VDR基因位點基因型與等位基因頻率分布[n(%)]

續表2 CHB患兒輕度組與中度組VDR基因位點基因型與等位基因頻率分布[n(%)]

表3 HBV B型組與HBV C型組VDR基因位點基因型與等位基因頻率分布[n(%)]

2.5CHB患兒VDR基因位點不同基因型間血清25(OH)D水平比較 CHB患兒VDR基因BsmI、ApaI、TaqI、FokI 4個位點不同基因型間血清25(OH)D水平比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 CHB患兒VDR基因位點不同基因型血清25(OH)D水平比較[M(P25，P75)]

續表4 CHB患兒VDR基因位點不同基因型血清25(OH)D水平比較[M(P25，P75)]

3 討 論

VDR屬于類固醇激素/甲狀腺激素受體超家族成員，是存在于多種細胞核和細胞膜上的可溶性蛋白，主要分布于心、腦、腎臟、肝臟、皮膚等多種組織器官中，以及巨噬細胞、單核細胞、T細胞、B細胞等各種免疫細胞中，此外在許多腫瘤細胞中也發現了VDR的表達。VDR基因定位于12號染色體長臂，含427個氨基酸殘基，相對分子質量為50×103。VDR通過調節靶基因轉錄介導活性維生素D發揮生物學效應，從而調節機體的固有免疫與適應性免疫反應。研究表明活性維生素D-VDR信號通路參與了涉及人體生理功能的900多種基因的表達與調控[9]，VDR基因多態性除了與鈣磷代謝有關外，還與腫瘤、代謝性疾病、感染性疾病、自身免疫性疾病等多種疾病的病理生理機制密切相關[3,10-14]。目前已發現的VDR基因多態性主要集中在4個SNPs位點，分別為第8內含子的BsmI位點和ApaI位點、第9外顯子的TaqI位點及第2外顯子的FokI位點。

近年來VDR基因SNPs與CHB關系的研究日益受到重視，VDR SNPs可以改變其編碼的VDR蛋白質的結構與生物學功能，HBV可能通過下調VDR的表達水平阻止活性維生素D對HBV轉錄與翻譯的抑制作用[4]，同時VDR與活性維生素D結合后可抑制1型輔助性T細胞的增殖與細胞因子的分泌，并激活2型輔助性T細胞的應答從而調節機體的免疫功能[15]，而CHB患者HBV的清除主要依賴于以1型輔助性T細胞應答為主的細胞免疫反應，因此VDR基因的不同表達可能與HBV易感性及疾病進程有一定的相關性。有研究指出，攜帶VDR FokI基因型CC、CT及等位基因C的個體具有更高的HBV易感性，CT與TT基因型的CHB患者對聚乙二醇干擾素的治療反應更強，FokI基因SNPs可作為HBV感染后預示肝細胞癌發生風險、評估疾病嚴重程度的分子標志物[3,5,16]；TaqI TT基因型和T等位基因與無癥狀HBV感染有關[17-18]；ApaI AA基因型與CHB患者高病毒載量和肝病嚴重程度相關[18]；BsmI BB基因型與HBV感染轉歸有一定的聯系[19]。而HE等[3]的Meta分析研究表明，BsmI、ApaI、TaqI位點的多態性與HBV易感性并無聯系，HOAN等[6]的研究亦指出，VDR基因BsmI、ApaI、TaqI、FokI 4個位點的多態性均與HBV感染風險無關，但ApaI位點的多態性與HBV感染患者的臨床結局和疾病進展相關。本研究中VDR基因BsmI、TaqI和FokI 3個位點的基因型和等位基因頻率在CHB組和對照組、CHB輕度組和中度組中的比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，而ApaI位點的基因型頻率分布在CHB組和對照組中的比較，差異有統計學意義(P<0.05)，CHB組的AC基因型頻率分布高于對照組，提示與ApaI CC基因型比較，攜帶AC基因型的兒童可能有更高的HBV感染風險(OR=2.213，95%CI1.130～4.335)，但ApaI各基因型在不同嚴重程度CHB患兒中的頻率分布比較，差異無統計學意義(P>0.05)，表明VDR基因SNPs可能與CHB患兒肝臟病變嚴重程度無關。上述研究結果不一致的原因可能與種族差異、地域環境差異、受試人群生活方式特征，以及研究方法和樣本選擇的不同等有關。

HBV有多個基因型，我國以B基因型和C基因型為主[7]，HBV基因型與疾病進展和干擾素治療應答有關，HBV e抗原陽性者B基因型對干擾素-α治療的應答率高于C基因型[20]。本研究中HBV B基因型和C基因型的CHB患兒VDR基因 BsmI、ApaI、TaqI、FokI 4個位點的基因型與等位基因頻率分布比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，提示VDR基因SNPs可能與HBV B基因型或C基因型的易感性無關。另外本研究還發現，CHB患兒VDR基因 BsmI、ApaI、TaqI、FokI 4個位點不同基因型間的血清25(OH)D水平比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，表明VDR基因SNPs在調控25(OH)D生物學功能的同時，可能并不影響血清中的25(OH)D水平，與相關研究一致[6]。本研究中與病例組比較，對照組兒童樣本量較小，存在一定的局限性，另外本次單中心研究未納入組織病理活檢診斷為重度CHB的患兒，可能導致研究結果不全面，有待進一步的多中心擴展研究與驗證。

綜上所述，本研究結果表明，VDR基因ApaI(rs7975232)位點多態性可能與兒童CHB易感性相關，攜帶AC基因型者發生HBV感染的危險性增高；未發現VDR基因位點(BsmI、ApaI、TaqI、FokI)多態性與CHB患兒肝臟病變嚴重程度、HBV基因型及血清25(OH)D水平的相關性。