胃癌患者外周血Th17細胞、血清IL-17、IL-6水平檢測及臨床意義

牟曉映 ，高美華 ，韓春華

1.青島大學醫學部基礎醫學院免疫學系，山東 青島 266071；

2.青島阜外心血管病醫院檢驗科，山東 青島 266034；

3.青島大學附屬醫院檢驗科，山東 青島 266003

胃癌在我國是最常見的消化道惡性腫瘤之一，死亡率較高。據統計，2015年我國胃癌新發生病例超過67萬例，死亡病例接近50萬例[1]。中國每年新發胃癌病例占全球新發病例的40%以上[2]，給人們生命健康帶來極大危害。近幾年研究發現胃癌與炎癥密切相關[3]。炎癥細胞因子通過炎癥介質的釋放誘發連續的炎癥反應，激活一系列免疫反應促進癌癥細胞的生長、侵襲和轉移，促進腫瘤血管生成，抑制免疫系統[4]。Th17細胞作為新型的效應T細胞，被視為炎癥反應重要調節因子，Th17細胞及其特征性細胞因子白介素17(IL-17)是免疫系統的重要組成部分，參與多種炎性疾病、自身免疫疾病、腫瘤的發展[5-7]。白介素6(IL-6)作為免疫調節性細胞因子，既參與炎癥反應，又參與Thl7細胞的增殖和分化。本文以胃癌患者為研究對象，檢測其外周血Thl7細胞與血清IL-17、IL-6水平，并分析其在胃癌中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取青島大學附屬醫院2017年1月至2017年12月收治的40例胃癌患者為觀察組，同時選取同期來院體檢的健康者40例作為對照組。所有患者手術前均未接受過放療、化療，且無傳染病及自身免疫性疾病史，未使用過免疫抑制劑，所有患者術后均經病理診斷證實為胃癌。觀察組患者中男性21例，女性19例；年齡46～76歲，中位年齡63歲；所有患者均按照國際抗癌協會臨床TNM分期標準進行分期，其中Ⅰ+Ⅱ期25例，Ⅲ+Ⅳ期15例；低分化22例，中高分化18例；有淋巴結轉移13例，無淋巴結轉移27例。對照組中男性23例，女性17例；年齡32～77歲，中位年齡51歲。

1.2 標本采集 觀察組于手術前一天清晨、對照組于體檢當日清晨空腹抽取靜脈血3 mL置于肝素抗凝管中，立即輕輕顛倒混勻5～10次，用于Thl7細胞頻率檢測；3 mL血液置于無添加劑生化管中，待凝固后離心分離血清，分裝，-80℃冰箱保存，檢測IL-17、IL-6濃度。

1.3 檢測儀器及試劑 流式細胞儀購自美國BD公司，人輔助性Th17細胞檢測試劑盒、抗人CD4-FITC抗體、抗人 PE-抗IL-17、同型對照PE-IgG1購自美國eBio-science公司，MK3酶標儀購自美國Thermo公司，血清IL-17、IL-6 ELISA試劑盒購自武漢基因美公司。

1.4 方法

1.4.1 外周血液中Th17細胞頻率檢測 取已經編號的各組研究對象空腹留取的肝素抗凝靜脈血3 mL，加入紅細胞裂解液1 mL，室溫條件下避光孵育10 min。1 000 r/min離心5 min，棄上清，滴加1 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸細胞。向各試管中加入佛波酯(PMA)50 μg/L、離子霉素(Ion)1 μg/L、莫能霉素1 μL/mL，并充分混勻置于37℃，5%CO2培養箱中培養4 h。吸取試管中樣本至EP管內，2 500 r/min離心6 min，棄上清，PBS沖洗。各測定管分別加入抗人CD4-FITC抗體，同型對照管加入等量的同型對照抗體PE-IgG1，室溫避光30 min，再用PBS洗2次，每管加入300 μL固定液，4℃避光孵育15 min。離心，棄上清。加入破膜液，3 000 r/min離心，棄上清，PBS洗2次，各實驗組分別加入20 μL PE-抗IL-17，對照組加入10 μL同型對照PE-IgG1，室溫避光30 min。PBS洗2次，1 000 r/min離心5 min，棄上清，PBS重懸。2 h內上機檢測。

1.4.2 血清IL-17、IL-6檢測 取待測標本血清，按照試劑盒說明書進行操作，本試劑盒采用雙抗體夾心法進行檢測，使用MK3酶標儀在450 nm下測定吸光度(OD值)，通過設定標準曲線來計算樣品中IL-17、IL-6濃度。

1.5 統計學方法 應用SPSS17.0軟件進行數據統計分析，計量資料符合正態分布，以均數±標準差()表示，兩兩比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組受檢者的Th17細胞頻率表達和血清IL-17、IL-6水平比較 觀察組患者的Th17細胞頻率、血清IL-17和IL-6水平明顯高于對照組，差異均有統計學意義(P＜0.05)，見表1。

表1 兩組受檢者的Th17細胞頻率表達和血清IL-17、IL-6水平比較()

表1 兩組受檢者的Th17細胞頻率表達和血清IL-17、IL-6水平比較()

images/BZ_35_1267_561_2267_624.png觀察組對照組t值P值40 40 1.32±0.23 0.79±0.15 11.51＜0.05 11.55±2.45 8.68±1.69 6.45＜0.05 199.45±24.42 80.36±14.86 26.08＜0.05

2.2 觀察組患者Th17細胞頻率表達、血清IL-17、IL-6水平與臨床特征的關系 觀察組患者Th17細胞頻率表達、血清IL-17、IL-6水平與臨床分期、腫瘤分化程度、淋巴結轉移有關(P＜0.05)，與性別、年齡無關(P＞0.05)，見表2。

表2 Th17細胞的頻率表達和血清中IL-17、IL-6的水平與胃癌患者臨床特征的關系

3 討論

胃癌是起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，遺傳和環境因素是影響胃癌發生發展的主要因素，有胃癌發生的患者其后代發生胃癌的比例比無家族遺傳史的人明顯要高，同時吸煙、喝酒以及食鹽攝入量、腌制食品食用量、深加工肉制品攝取量、新鮮蔬菜水果食用量、幽門螺桿菌感染情況均與胃癌的發生有相關性[8-11]。胃癌作為多因素所致的腫瘤疾病，其診斷金標準為胃鏡檢查，但胃鏡檢查患者耐受性低，費時費力，成本又高，很多患者不易接受，血清標志物檢測易于取材，成本較低，快速又準確，更利于癌癥患者的早發現早診斷早治療，提高患者生存率。相關研究發現，Th17細胞及其產生的IL-17在腫瘤診斷中的作用越來越被重視，其在腫瘤組織、免疫微環境、血液中的改變可引起腫瘤發生變化。Th17細胞是新興的輔助性CD4+T細胞亞群，由IL-6和TGF-β共同啟動其分化發育，由IL-23誘導其分化成熟并產生特異性因子IL-17。李巧霞等[12]報道胃癌患者外周血中TH17細胞比例顯著增多，且與非癌對照組織相比，觀察組織內CD4+/IL-17+細胞浸潤明顯增多。本研究運用流式細胞技術檢測外周血中Th17細胞頻率，用ELISA試驗檢測IL-17血清濃度。結果顯示，與健康體檢者(0.79±0.15)%相比，胃癌患者外周血中Th17細胞頻率(1.32±0.23)%顯著增高；胃癌患者血清IL-17濃度為(11.55±2.45)pg/mL，明顯高于健康體檢者的(8.68±1.69)pg/mL，與其研究結果相一致。李清靖等[13]研究發現，Thl7細胞比例的增多與胃癌患者臨床分期、淋巴結轉移有關，本實驗也證實Th17細胞頻率、IL-17濃度水平與患者胃癌分期、淋巴結是否轉移、腫瘤分化程度相關，Ⅲ+Ⅳ期患者高于Ⅰ+Ⅱ期患者，低分化患者高于中高分化患者，有淋巴結轉移患者高于無淋巴結轉移患者，差異有統計學意義(P＜0.05)。

IL-6是一種具有多向性、多種生物學功能的細胞因子，是參與TH17細胞活化啟動所必需的細胞因子之一[14]，IL-17升高誘導IL-6表達增加，同時IL-6增加誘導TH17細胞生成更多的IL-17[15]。本研究中胃癌患者血清IL-6濃度明顯高于健康體檢者，IL-6濃度與患者年齡、性別無關，與患者臨床分期、腫瘤分化程度、淋巴結轉移相關，晚期患者高于早期患者，低分化患者高于中高分化患者，有淋巴結轉移患者高于無淋巴結轉移患者，差異均有統計學意義(P＜0.05)。這一結果與王丹[16]研究結果一致。IL-6可能通過促進瘤內血管的生成、調控細胞生成基因、加快腫瘤干細胞增殖以及產生適應腫瘤生長的炎癥環境等作用機制參與腫瘤的發生發展過程[17]。本研究表明胃癌患者Thl7細胞頻率、IL-17、IL-6增高，導致患者體內免疫功能發生紊亂，Thl7細胞、IL-17、IL-6可能共同參與了胃癌的發生發展過程。

蔣偉等[18]報道微環境中Thl7細胞的表達與胃癌患者的預后呈正相關，而ZENG等[19]報道觀察組織中IL-17高表達患者總生存率較差，彭春偉等[20]報道IL-6表達水平對預測胃癌患者的生存期無臨床價值。本文在Thl7/IL-17、IL-6對胃癌動態發展的影響以及對胃癌的預后價值這兩方面仍有待于進一步研究。

綜上所述，胃癌患者血液中TH17、IL-17和IL-6高表達，Th17細胞及其細胞因子與胃癌密切相關，炎性細胞因子可能在胃癌的診斷治療方面發揮更重要的作用。