PGC-1α基因缺失對β-淀粉樣蛋白誘導小鼠神經毒性的影響

孫治坤 馬興榮 陳 帥 賀 爽 張杰文△

1)河南省人民醫院，河南 鄭州 450003 2)鄭州大學第一附屬醫院，河南 鄭州 450052

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種逐漸進展的退行性疾病，隨著患者年齡的增加其癥狀也會逐漸惡化，并最終影響患者的日常生活行為能力[1]，其發病率是所有老年性癡呆類型中最高的一種。2019阿爾茨海默病協會報告指出，目前美國的AD患者約580萬，預計到2050年，美國的AD患者將達到1 380萬[2]。由于AD的潛伏期較長，研究認為在AD患者出現癥狀前20 a或更長的時間就開始出現腦部的一些病理變化，如出現大腦中參與思考、學習和記憶(認知功能)的部分神經元被破壞[3-4]，長期的這些大腦病理變化逐漸導致患者出現臨床癥狀，如記憶力減退及言語障礙等，因此研究AD的發病機制，特別是早期的病理變化具有重要意義。但目前AD的發病機制還不完全清楚，主要與β-淀粉樣蛋白的沉積和降解障礙有關[5-6]，研究認為Aβ的沉積和降解障礙導致Aβ的聚集，可誘發tau蛋白的超磷酸化、神經元丟失及突觸傳遞功能障礙等一系列病理變化，最終導致臨床上出現認知功能障礙。過氧化物酶體增殖物激活受體-γ共激活因子-1α(PGC-1α)是調節線粒體生物合成及功能的核心因子[7-8]，具有調節能量代謝、氧化應激和線粒體的生物合成等功能。PGC-1α在哺乳動物體內的表達具有一定的組織特異性，主要存在于線粒體含量豐富的組織且對高能量需求較多的組織，如脂肪組織、骨骼肌、心臟、肝、腦及腎等組織。在鼠類腦組織中PGC-1α主要表達在皮質、紋狀體、黑質、丘腦、海馬和小腦的神經元[9]，尤其在GABA能神經元中表達較多，但在膠質細胞中幾乎不存在[9-10]。由于PGC-1α在腦內廣泛分布再加上它的生理功能，因此其與和氧化應激及線粒體功能障礙有關的一些神經系統疾病，如AD[11]、帕金森病[12]、亨廷頓病[13]等的發生發展具有密切的相關性。既往研究[14-17]也證實了這一點，然而目前國內外對PGC-1α在AD發病機制中作用的研究還處于起步與探索階段。既往研究表明PGC-1α基因與AD的發病有明顯相關性[16]，然而目前的研究尚不確定在整體實驗中PGC-1α的降低或缺失對Aβ的神經毒性作用有無影響，因此本研究采用PGC-1α基因缺失小鼠觀察Aβ對小鼠學習記憶功能、腦內膽堿能系統及氧化應激等的影響，旨在為AD發病機制的研究提供新的理論基礎。

1 材料與方法

1．1實驗對象及分組研究對象為健康的雄性PGC-1α基因敲除小鼠和C57BL/6小鼠各12只，均來自美國杰克遜實驗室，體質量20～22 g，月齡8～12周，常規飼養3 d后按照隨機原則將每種基因型組小鼠分為對照組和Aβ注射組，每組6只。

1．2Aβ的處理Aβ1-40購買(Sigma公司)后加入生理鹽水制成濃度為10 μg/μL的凝聚狀態，在-80 ℃的冰箱里保存待用，使用前1 d從冰箱里取出然后在37 ℃溫箱里孵育約24 h后使用。

1．3手術操作兩種基因的Aβ注射組小鼠用10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔內注射進行麻醉，小鼠顱骨用腦立體定位儀進行固定，經過備皮和消毒后，在頭顱的頂中線切開一約1 cm的切口，仔細分開皮下組織，暴露出前囟中心點，然后以該點作為一個新的基準，在其后0.5 mm、中線旁1.0 mm處垂直進針，使用牙科鉆鉆開顱骨，5 μL微量進樣器向小鼠顱內雙側側腦室慢慢注入1 μL凝聚態的Aβ1-40，留針約5 min后緩慢撤針，然后進行皮膚的縫合和傷口的消毒等處理。兩種基因組的對照組小鼠在雙側側腦室里的注射物用等體積的生理鹽水代替凝聚態的Aβ1-40，其他手術步驟及手術條件均相同。手術完成4周后進行各指標的測定。

1．4行為學評估依照以前的實驗方法[18-19]，Morris水迷宮設備來自中國醫科院，由3個部分組成：圓形的水池、攝像系統和分析系統。評估分為兩個部分：(1)定位航行測試：對小鼠進行為期4 d的訓練和測試。圓形水池的直徑120 cm，壁為黑色，水中添加黑色食用色素使水變為黑色，水深30 cm，溫度維持在22 ℃左右，將水池平均劃分為4個象限，在第二個象限中放入一直徑約9 cm的黑色圓形小平臺，距離水面下1～2 cm。各組研究對象每天接受4次訓練，每次180 s，每兩次訓練的間隔時間30 min，按隨機原則選擇每次訓練的入水點，如果動物相鄰2 d具有相同的入水順序，則重新進行隨機化選擇。如果在訓練時間內小鼠能爬上平臺，則讓它在臺上停留30 s；如果小鼠不能發現平臺，可把它指引到平臺上并停留30 s。用攝像頭追蹤小鼠的游泳軌跡，并輸入計算機中計算小鼠到達平臺前的時間(潛伏期)和游泳距離。(2)空間搜索測試：在測試的第5天把小平臺撤掉，然后隨機分兩次將小鼠放入水中，放入點為離原平臺位置較遠的兩個象限，然后記錄并分析小鼠在原第二象限內停留的時間和游泳距離占總游泳時間或總游泳距離的百分比。

1．5小鼠皮質和海馬組織內膽堿乙酰轉移酶(ChAT)、乙酰膽堿酯酶(AchE)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)及丙二醛(MDA)活性的檢測依照之前的方法[18-19]，準備好冰盤和預冷的PBS液，小鼠經斷頭處死后，即刻剝離出腦組織，用預冷的PBS液沖刷干凈后放入冰盤，快速仔細地分離出雙側的大腦皮質和海馬組織，在冰浴中分別加入等量的冰生理鹽水進行勻漿，然后在4 ℃的離心機中以5 000 r/min的速度離心10 min后取上清液為待測樣品。檢測各指標之前首先用BCA(購自Pierce公司，美國)法測定蛋白含量，然后按照試劑盒說明書檢測各項指標(ChAT及AchE試劑盒來自中國南京建成生物工程研究所；GSH試劑盒來自美國Cayman Chemical公司；MDA和SOD試劑盒購自中國賽默飛世爾科技有限公司)。

2 結果

2．1Aβ對不同基因組小鼠學習記憶能力的影響

2．1．1 定位航行測試：訓練前3 d各組測試對象平均上臺前的潛伏期(第1天：F=0.813，P=0.457；第2天：F=1.369，P=0.277；第3天：F=1.436，P=0.261；圖1A)以及上臺前的游泳距離(第1天：F=0.297，P=0.83；第2天：F=0.565，P=0.645；第3天：F=0.725，P=0.549；圖1B)均無明顯差異。隨著訓練時間的增加，各組測試對象找到平臺前所用時間及游泳距離均不斷縮短。但第4天時各組測試對象平均上臺前的潛伏期(F=16.464，P=0.000)及上臺前的游泳距離(F=47.121，P=0.000)均出現明顯差異，與同種基因小鼠的對照組相比，兩種基因Aβ注射組小鼠的平均上臺前所用時間(正常基因Aβ組：P=0.000；PGC-1α基因敲除Aβ組：P=0.000；圖1A)和游泳的距離(正常基因Aβ組：P=0.000；PGC-1α基因敲除Aβ組：P=0.000；圖1B)均明顯增高，且PGC-1α基因敲除小鼠注射Aβ組的平均上臺前所用時間(P=0.004，圖1A)和游泳的距離(P=0.003，圖1B)均明顯高于正常基因小鼠注射Aβ組。

2．1．2 空間搜索試驗：平臺被撤除后各組測試對象在平臺所在象限中游泳的時間百分比(F=62.078，P=0.000)和距離百分比(F=56.907，P=0.000)均出現明顯差異。與同種基因小鼠的對照組相比，兩種基因Aβ注射組動物在平臺所在象限中游泳的時間百分比(正常基因Aβ組：P=0.000；PGC-1α基因敲除Aβ組：P=0.000；圖2A)和距離百分比(正常基因Aβ組：P=0.000；PGC-1α基因敲除Aβ組：P=0.000；圖2B)均明顯降低，而PGC-1α基因敲除小鼠注射Aβ組在平臺所在象限中游泳的時間百分比(P=0.000，圖2A)和距離百分比(P=0.000，圖2B)明顯低于正常基因小鼠注射Aβ組。

圖1 Aβ對不同基因組小鼠的學習記憶功能的作用 A：平均上臺前各組小鼠的時間(潛伏期)；B：平均上臺前各組小鼠游泳的距離(與同種基因對照組比較，*P<0.05；與正常基因Aβ組比較，#P<0.05)Figure 1 Effect of beta-amyloid on memory impairment in mice.The Morris water maze was used to evaluate the spatial learning and memory ability by measuring escape latency (A) and escape distances (B).*P<0.05 vs the same genome control group，#P<0.05 vs Aβ treatment normal genome group

圖2 Aβ對不同基因組小鼠的學習記憶功能的作用 A：平臺被撤除后各組小鼠在原來平臺所在象限中游泳的時間百分比；B：平臺被撤除后各組小鼠在原來平臺所在象限中游泳的距離百分比(與同種基因對照組比較，*P<0.05；與正常基因Aβ組比較，#P<0.05)Figure 2 Effect of beta-amyloid on memory impairment in mice.A probe test was used to analyze maintenance of memory in the Morris water maze by measuring the percentage of time spent (A) and swimming distance percentage (B) in the target quadrant．*P<0.05 vs the same genome control group，#P<0.05 vs Aβ treatment normal genome group

2．2Aβ對不同基因組小鼠皮質和海馬組織內ChAT和AchE活性的影響各組小鼠皮質和海馬組織內ChAT和AchE活性的變化均出現明顯差異(表1)。與同種基因組的對照組相比，兩種不同基因小鼠注射Aβ組動物腦皮質和海馬組織內的ChAT活性均明顯降低(腦皮質：正常基因Aβ組P=0.000，PGC-1α基因敲除Aβ組P=0.000；海馬：正常基因Aβ組P=0.000，PGC-1α基因敲除Aβ組P=0.000)，而AchE的活性卻明顯升高(腦皮質：正常基因Aβ組P=0.000，PGC-1α基因敲除Aβ組P=0.000；海馬：正常基因Aβ組P=0.000，PGC-1α基因敲除Aβ組P=0.000)；與正常基因小鼠注射Aβ組相比，PGC-1α基因敲除小鼠注射Aβ組腦皮質及海馬組織內ChAT活性明顯降低(腦皮質：P=0.001；海馬：P=0.02)，而AchE的活性明顯升高(腦皮質：P=0.000；海馬：P=0.011)。見表1。

表1 Aβ對不同基因組小鼠皮質、海馬ChAT和AchE活性的作用Table 1 Effect of beta-amyloid on the ChAT and AchE activity in cortex and

2．3Aβ對不同基因組小鼠大腦皮質和海馬內氧化應激相關因子(SOD、GSH及MDA)活性的影響各組小鼠大腦皮質和海馬組織內氧化應激相關因子的變化均出現明顯差異(表2)。與同種基因組的對照組相比，兩種不同基因Aβ注射組動物大腦皮質和海馬組織內的SOD(腦皮質：正常基因Aβ組P=0.000，PGC-1α基因敲除Aβ組P=0.000；海馬：正常基因Aβ組P=0.000，PGC-1α基因敲除Aβ組P=0.000)及GSH(腦皮質：正常基因Aβ組P=0.000，PGC-1α基因敲除Aβ組P=0.000；海馬：正常基因Aβ組P=0.000，PGC-1α基因敲除Aβ組P=0.000)的活性均明顯降低(P<0.05)，而MDA的活性卻明顯升高(腦皮質：正常基因Aβ組P=0.000，PGC-1α基因敲除Aβ組P=0.000；海馬：正常基因Aβ組P=0.000，PGC-1α基因敲除Aβ組P=0.000)；與正常基因小鼠注射Aβ組動物相比，PGC-1α基因敲除小鼠注射Aβ組動物的大腦皮質和海馬組織內SOD(腦皮質：P=0.027；海馬：P=0.001)及GSH(腦皮質：P=0.000；海馬：P=0.014)的活性均明顯降低，而MDA的活性則明顯升高(腦皮質：P=0.000；海馬：P=0.000)。見表2。

表2 Aβ對不同基因組小鼠皮質和海馬組織內SOD、GSH及MDA活性的作用Table 2 Effect of beta-amyloid on the SOD，GSH and MDA activity in cortex and

3 討論

PGC-1α是一種輔助激活核受體PPARγ的激活因子，該名字由其功能而來，在調節線粒體的功能和生物合成過程中具有重要作用[20-21]。既往研究表明其與多種神經系統疾病的發生發展具有密切的相關性，如在帕金森病的研究中，ZHENG等[22]用全基因組的Meta分析發現帕金森病患者中PGC-1α及其調控的下游基因表達下降。WANG等[23]研究認為PGC-1α的過表達可保護MPTP誘導的C57BL小鼠帕金森病模型的行為障礙及黑質中線粒體功能障礙[23]。SUN等[24]研究發現PGC-1α基因敲除小鼠可出現運動功能障礙及多巴胺神經元的丟失。對亨廷頓病的研究也發現，在亨廷頓病患者及動物模型的紋狀體中均發現PGC-1α表達的降低[25-26]，在亨廷頓病轉基因動物模型中β-拉帕酮可通過調節PGC-1α的活性而改善小鼠的運動障礙及線粒體功能的損傷[27]。然而目前對PGC-1α在AD發病機制中作用的研究還處于起步與探索階段。

QIN等[28]利用全基因組微陣列分析的研究證明了PGC-1α在AD患者腦中RNA的表達隨著AD患者癡呆病情的進展而顯著降低，同時發現PGC-1α的蛋白含量與老年斑的病理學及腦內Aβ的含量呈負相關。KATSOURI等[29]利用病毒載體將PGC-1α注入APP23轉基因鼠AD模型的腦內發現，注射PGC-1α的小鼠可通過減少β分泌酶的表達而減少Aβ斑塊的產生，保護了大腦中的神經元凋亡。然而DUMONT等[30]的研究則給出了不同結論，其研究發現PGC-1α的過度表達可通過誘導線粒體異常、神經細胞死亡和行為亢進加劇Tg19959轉基因小鼠的APP基因突變及與人類AD相關的神經病理學和行為學缺陷。在細胞水平的研究上，ZHANG等[31]研究發現PGC-1α能通過調節NF-κB信號傳導通路保護Aβ誘導的神經母細胞瘤細胞的凋亡和炎癥反應，然而目前的研究尚不確定整體實驗中PGC-1α的降低或缺失對Aβ的神經毒性作用有無促進作用，因此本研究首次采用PGC-1α基因敲除小鼠整體水平上來研究PGC-1α對Aβ神經毒性作用，旨在為研究AD的發病機制提供新的理論基礎及新的思路。

本研究發現PGC-1α基因敲除小鼠與正常基因小鼠的側腦室注射入Aβ1-40后，PGC-1α基因敲除小鼠的學習記憶功能較正常基因小鼠明顯減退，結合中樞膽堿能系統相關指標的檢測結果發現，PGC-1α基因敲除小鼠注射Aβ后較正常基因小鼠注射Aβ后腦內ChAT的活性明顯下降而AchE活性明顯升高。既往研究發現氧化應激與阿爾茨海默病的發病密切相關[32-34]，在AD發病過程中氧化應激反應具有重要作用，Aβ的聚集會將會導致大量活性氧自由基的產生，活性氧自由基可誘發神經細胞膜上不飽和脂肪酸的過氧化反應，生成的過氧化脂質體(如丙二醛等)可以進一步破壞細胞膜蛋白的生理功能，最終導致神經細胞功能的喪失及代謝紊亂，引起患者臨床上學習認知及記憶功能的明顯下降[35-36]。大量產生的氧自由基又反過來干擾Aβ的降解，促進Aβ的聚集[37]。線粒體可以調節細胞內氧化-還原狀態，它是體內活性氧自由基產生的主要部位[38]。研究表明PGC-1α在調節線粒體氧化應激的過程中可直接調節多種抗氧化因子的表達，如錳超氧化物歧化酶、過氧化物酶3和5、過氧化氫酶、硫氧還蛋白2、解偶聯蛋白2和硫氧還蛋白還原酶等，從而防止氧化損傷和線粒體功能障礙[39-41]。本研究通過檢測各組動物腦內氧化應激相關指標發現，PGC-1α基因敲除小鼠注射Aβ組較正常基因小鼠注射Aβ組腦內SOD及GSH的活性明顯降低，而MDA的活性則明顯升高，提示PGC-1α基因的敲除可加重Aβ1-40誘發的氧化應激損傷。

本研究利用PGC-1α基因敲除小鼠從整體水平研究了PGC-1α基因的敲除可加重Aβ1-40誘導的小鼠的學習記憶障礙，其作用是通過膽堿能系統的調節失衡及加重氧化應激損傷實現的，本研究為深入探討AD發病機制的研究提供了新的思路及理論基礎。