黃連素對脂肪細胞脂聯素分泌的影響及分子機制

夏文燕 藍金花 許 榮 呂維名

（贛南醫學院第一附屬醫院，江西贛州 341300）

脂聯素是脂肪細胞分泌的脂肪細胞因子，其分泌量與肥胖和胰島素抵抗呈負相關[1]。高糖環境可誘發內質網應激（Endoplasmic reticulum stress，ERs）[2]，損傷脂肪細胞的分泌功能。目前研究證實，黃連素是一種異喹啉類生物堿，可以改善脂聯素的分泌，調節糖脂代謝[3]。但國內外尚未有關于黃連素對高糖介導的3T3-L1 脂肪細胞內質網應激對脂聯素分泌的影響及具體機制的報道。本研究探討黃連素對高糖介導的3T3-L1 脂肪細胞內質網應激對脂聯素蛋白分泌的影響，并進一步探討是否通過下調內質網應激蛋白PERK/eIF2a水平改善脂聯素的可能分子機制，結果如下。

1 資料與方法

1.1 主要試劑

3T3-L1前 脂 肪 細 胞 株（American Type culture collection，ATCC）；高糖（DMEM）培養基（ DMEM 美國 GIBCO 公司）；高糖無酚紅（DMEM）培養基（美國 Sigmag公司）；胎牛血清（美國 GIBCO 公司）；地塞米松（DEX，D4902）（美國 SIGMA 公司）；胰島素（若和靈 R）（丹麥諾和諾德公司）；黃連素購于上?？稻呕び邢薰?；葡萄糖購自北京益利精細化學品有限公司；兔抗人eIF2a 單克隆 抗體（美國BPB公司）；蛋白激酶R樣內質網激酶（PERK），（1∶200稀釋，美國Santa Cruz），p-PERK（1∶1 000稀釋，美國Santa Cruz）及脂聯素抗體（武漢博士德公司）。

1.2 方法

1.2.1 3T3-L1前脂肪細胞的誘導分化 3T3-L1前脂肪細胞用10%的胎牛血清高糖DMEM培養液，在 37 ℃、7% CO2培養箱中培養。細胞融合率達到 80%～90% 時，用胰蛋白酶（0.25%）消化并傳代于6孔培養板上。待細胞融合后，加含1μmol/L地塞米松和0.5 mmol/L 1-甲基-3-異丁基-黃嘌呤及10μg/mL 胰島素的DMEM培養液培養48 h；以含10μg/mL 胰島素的DMEM培養液再培養48 h，以DMEM培養液繼續培養6 d，10 d左右的誘導分化90%3T3-L1細胞呈脂肪細胞表型，細胞內見脂滴。

1.2.2 3T3-L1脂肪細胞分組 將3T3-L1脂肪細胞分三組，每組用無血清培養液預處理 6 h同步化后，設對照組，高糖組，高糖+黃連素組（黃連素組）。對照組不加任何處理，溫育24 h；高糖組加入葡萄糖至終濃度25.5 mmol/L，溫育24 h；在黃連素組加入黃連素（20 umol/L）和高糖（25.5 mmol/L），溫育24 h。

1.2.3 Western blot 檢測蛋白的表達 總蛋白樣品用SDSPAGE電泳分離后轉移至PVDF膜，以5%脫脂奶粉封閉，加入p-PERK、PERK、eIF2a、脂聯素、actin多克隆抗體孵育至少12 h，洗滌，加入標記辣根過氧化酶（HRP）的II抗室溫孵育1 h，再洗滌。用ECL顯影劑顯影，以激光掃描儀進行定量掃描。

1.3 統計學分析

采用SPSS 20.0軟件進行數據統計分析，計量資料以（）表示，采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 黃連素組抑制高糖誘發的 3T3-L1 脂肪細胞內質網應激元件蛋白表達

結果顯示，高糖組中內質網應激蛋白p-PERK、eIF2a分別與對照組、黃連素組相比，差異有統計學意義（P＜0.01），見圖1-3。

2.2 黃連素和高糖對脂肪細胞脂聯素的影響

用 Western blot 檢測脂聯素蛋白水平，高糖組與對照組比，差異有統計學意義（P＜0.01），黃連素組與高糖組比，差異有統計學意義（P＜0.01），見圖4-5。

3 討論

脂聯素為脂肪細胞分泌因子中的代表性成員，為脂肪細胞特異性分泌。脂聯素在調節糖脂代謝的穩態中發揮重要作用，有研究證實，在脂聯素敲除大黃魚中出現明顯的胰島素抵抗、肥胖[4]。脂聯素轉基因的小鼠即使采用高脂喂養，卻可明顯抑制脂肪細胞的肥大、脂肪組織炎癥等，在肝臟中脂聯素可以抑制糖異生，改善非酒精性脂肪肝的形成[5]。脂聯素的減少對代謝綜合癥的發生發展有重要意義。故研究藥物能否抑制脂聯素的下降及作用靶點具有重要意義。

此外，內質網應激參與糖脂代謝紊亂的重要地位已被證實[6]。內質網應激導致未折疊和錯誤折疊的蛋白在內質網上堆積增多，并啟動未折疊蛋白反應（UPR）。內質網應激蛋白至少包括三個定位在內質網膜上出現在胞漿內質網腔域的直接信號成員，包括PERK，（ATF）6，IRE1[7]。PERK是內質網上的絲蘇氨酸蛋白激酶，可以激活下游的真核生物翻譯啟動因子2 a亞組（eIF2a），eIF2a活化后隨后抑制蛋白的合成并防止新生蛋白進一步流入飽和的內質網腔中，保護細胞，但隨著內質網應激的延長，使得通路激活其它信號分子，參與疾病的病理變化，促進細胞受損及凋亡。持續高糖環境可誘發脂肪細胞內質網應激，導致脂肪細胞分泌功能紊亂。研究證實高糖可誘發內質網應激元件PERK磷酸化并通過eIF2a途徑引誘各種抗氧化物的生成。本研究結果發現，經高糖處理后，p-PERK和eIF2a蛋白水平增高，顯著高于對照組。此外，本研究發現，高糖（25 mmol/L）可以抑制脂聯素的分泌，提示高糖有可能通過激活內質網應激通路PERK和eIF2a來抑制脂聯素的分泌。

黃連素是一種天然植物提取物，毒副作用小，價格便宜，對改善糖脂代謝有明顯療效，是潛在的治療糖尿病的藥物。已有研究證實[8]，黃連素可以抑制大鼠骨骼肌的內質網應激相關蛋白，改善胰島素抵抗。在本研究中，結果提示黃連素處理后，內質網應激元件PERK、eIF2a蛋白水平減少，脂聯素分泌上調，其蛋白水平與高糖組有顯著差異（P＜0.05），這提示黃連素可能參與了抑制高糖激活的內質網應激通路PERK/eIF2a來上調脂聯素的分泌，發揮改善胰島素抵抗的作用。

綜上所述，高糖可抑制脂聯素的分泌，黃連素可以改善高糖誘發的脂肪細胞的這種分泌異常，并可能通過抑制內質網應激PERK/eIF2a通路來抑制高糖所誘發的脂聯素下降。了解作用靶點和機制可為臨床用藥提供相關依據，但是否還有其它機制共同調節還有待進一步研究。