鯉食物轉化率相關候選基因ffar3 序列與表達分析

張曉峰，欒培賢，戶國

（中國水產科學研究院黑龍江水產研究所，淡水魚類育種國家地方聯合工程實驗室，黑龍江 哈爾濱 150070）

鯉Cyprinus carpio L.在我國分布最廣，養殖量在水產養殖業中占很大的比重[1]，是最重要的淡水魚類之一。近年來，我國開展了大量鯉遺傳改良的分子遺傳學研究，生長和食物轉化率作為魚類遺傳改良的兩個主要的生產性能，已取得很多有價值的研究進展[2-7]。

據統計，飼料費用約占總產值的65%～75%[8-10]，食物轉化率是水產養殖業最重要的經濟性狀之一，迫切需要改良現有水產養殖種類的食物轉化效率，節約飼料費用。食物轉化率是復雜的數量性狀，受多種因素影響，但遺傳基礎即基因起決定性作用[11-14]。找到重要經濟性狀相關的標記或基因，對此進行分子遺傳改良，將增強對數量性狀的遺傳操控能力，使數量性狀的優良基因在育種中有目的地聚合或替代，提高育種效率。但水產動物的個體食物轉化率性狀難于測量，很多水產養殖種都沒有開展相關的分子育種工作，僅在鯉中有少量報道[7,15,16]。近年來，本研究團隊利用遺傳連鎖圖譜QTL 定位分析和關聯分析，獲得了食物轉化率相關的QTL 和候選基因[17,18]，但是，鯉食物轉化率候選基因的相關機理研究仍然沒有開展。

明確解析鯉攝食和食物轉化率的調控機理對其養殖業意義重大，隨著高密度遺傳連鎖圖譜的構建和QTL 精細定位，使得候選基因精確定位成為可能。本文利用高密度遺傳連鎖圖譜通過QTL 精細定位獲得了食物轉化率相關候選基因（Free fatty acids receptor 3，ffar3）。本研究通過鑒定分析該基因的序列和結構，探究鯉ffar3 基因組織特異性表達模式及攝食對該基因mRNA 表達水平的影響，為闡明ffar3基因的作用機理和作用通路，探討這些基因在鯉攝食調控中的作用，提供客觀證據和研究基礎，更好地應用于鯉食物轉化率和生長性狀的選擇育種。

1 材料與方法

1.1 實驗魚

實驗用健康1 齡鯉，體質量約200 g，采自黑龍江水產研究所呼蘭試驗站；攝食實驗在黑龍江水產研究所實驗室進行。將40 尾實驗魚（試驗需20 尾）在40 個水族箱中飼養2 周，每天上、下午投喂2次。2 周后，正常投喂后開始采樣（投喂后10 min 之內），進食0 h（對照組）、2 h、4 h 和6 h 分別取樣5尾，用MS-222 麻醉后，解剖取適量腦、腸、肝臟和肌肉等新鮮組織，迅速投入RNAlater（Qiagen）中，置于-20 ℃冰箱中保存備用。

1.2 鯉總RNA 的提取

采用RNeasy Lipid Tissue Mini Kit 組織提取試劑盒（Qiagen），參照標準流程提取試驗樣本的RNA。提取后的RNA 經Nanodrop8000 檢測RNA 純度及濃度，1%的瓊脂糖凝膠檢測其完整性符合質量要求后，置于-80 ℃保存備用。

1.3 基因生物信息學分析

利用核酸序列在線分析工具Expasy（https://web.expasy.org/translate/）預測基因的開放閱讀框及氨基酸序列；利用Expasy 在線工具中的ProtParam程序（https://web.expasy.org/protparam/）計算預測蛋白質的理論等電點和分子量信息；利用在線工具SignalP 5.0（http:// www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預測信號肽序列；利用cluster x1.83 軟件進行序列多重比對，分析氨基酸同源性；利用SMART 在線分析軟件[19]（http://smart.embl.de/smart/）分析蛋白結構和功能。應用MEGA 4.0 軟件進行1 000 次bootstraps 值驗證，構建系統發育樹。用MEGA 4.0[20]中的Neighbor-Joining 法構建，重復10 000 次。

1.4 基因表達的定量分析

1.4.1 第一鏈cDNA 的合成

用SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR 試劑盒（Invitrogen）合成第一鏈cDNA，每個反應反轉錄1 μg 總RNA，按照試劑盒的操作說明進行，合成的cDNA 置于-20 ℃保存備用。

1.4.2 引物設計與合成

根據ffar3 基因的mRNA 序列，利用軟件Primer 5.0，綜合考慮熒光定量PCR 引物的設計原則，結合鯉全基因組比對分析，設計1 對特異性引物用于定量PCR 擴增，內參基因為鯉β-actin（表1）。引物由金唯智生物科技有限公司合成。

1.4.3 基因組織表達的定量分析方法

首先進行普通PCR 檢測，確保PCR 產物條帶單一，無引物二聚體，并將引物擴增片段回收、測序，以確保所擴增的目的片段為鯉ffar3 基因，再用熒光定量試劑盒進行PCR 擴增。定量PCR 試劑盒為One Step SYBRPrime ScriptTMRT-PCR Kit II（TaKaRa），按照操作說明步驟，使用ABI 7500 實時熒光定量PCR 儀（ABI）進行Real-Time PCR 反應。反應體系20 μL，包括SYBR Premix Ex Taq TM（2×）10 μL，正向及反向引物（10 μmol/L）各0.4 μL，ROX Reference Dye Ⅱ0.4 mL，模板cDNA 1 μL，用ddH2O補足至20 μL。反應條件為兩步法程序：95 ℃預變性10 s；擴增40 個循環，每個循環95 ℃變性5 s、58℃退火34 s。反應結束后，溶解曲線的反應條件為：95 ℃持續15 s，58 ℃持續1 min，95 ℃持續15 s。每個樣品重復實驗3 次取均值，PCR 反應結束后，使用ABI 7500 熒光定量PCR 儀自帶軟件包分析溶解曲線，計算△CT 值，以對照樣組樣品為參照子（calibrator）計算相應的△△CT。最后計算目標基因表達差異相對于內參因子基因表達的倍數[21]。所得數據采用SPSS17.0 軟件進行數據統計分析和顯著性檢驗（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 ffar3 基因的cDNA 序列分析和推導的氨基酸序列

鯉ffar3 基因（KTG39201.1；鯉ID：CAFS_CommonC_G_004020，V2.0）位于鯉全基因組裝配圖譜scaffold290 上，全長序列為3 318 bp，具有一個長度為990 bp 的完整開放式閱讀框（457～1 446 bp），編碼329 個氨基酸。其N 末端有一個長22 殘基的預測信號肽，信號肽序列MAWTVSLSNLVLAVYGF TLITG（1～22 aa）（圖1）。預測FFAR3 編碼蛋白的分子量約為37.83 kD、理論等電點（PI）為9.10。TMHMMServer v2.0 預測結果顯示，該基因含有7 個跨膜螺旋結構區域，分別為TM1（10～32 bp）、TM2（45～67 bp）、TM3（82～104 bp）、TM4（125～147 bp）、TM5（184～206 bp）、TM6（219～241 bp）和TM7（256～278 bp）（圖2）。不穩定系數為47.03，提示該蛋白為不穩定蛋白。脂肪系數為101.91，親水性系數為0.462，預測該蛋白為疏水性蛋白。

2.2 鯉ffar3 基因與其他物種的序列比對與系統進化樹分析

利用鯉ffar3 序列在NCBI 中BLAST 獲得已知其他物種的ffar3 基因的同源序列，包括人（Homo sapiens，XP_011525160.1）、牛（Bos taurus，XP_015313546.1）、小鼠（Mus musculus，NP_001028488.1）、大鼠（Rattus norvegicus，XP_017444965.1）、鯨（Globicephala melas，XP_030730408.1）、黑猩猩（Pan troglodytes，XP_001159667.1）雞（Gallus gallus，XP_025002082.1）、豬（Sus scrofa，NP_001302530.1）、非洲爪蟾（Xenopus tropicalis，XP_002938261.3）、江豚（Neophocaena asiaeorientalis，XP_024589790.1）、斑點叉尾（Ictalurus punctatus，XP_017308220.1）、斑馬魚（Danio rerio，XP_017206922.1）、半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis，XP_008321219.1）、牙鲆（Paralichthys olivaceus，XP_019964450.1）、青鳉（Oryzias melastigma，XP_024151711.1）、劍尾魚（Xiphophorus couchianus，XP_027869468.1）、虹鱒（Oncorhynchus mykiss，XP_021427435.1）和大刺鰍（Mastacembelus armatu，XP_026156454.1）等共18 個基因的蛋白序列。同時下載尼羅羅非魚（Oreochromis niloticu，XP_019219832.1）ffar2（free fatty acid receptor 2-like）基因作為構建進化樹的外類群（outgroup）。

用Cluster W 軟件對多物種FFAR3 氨基酸序列的同源性比對結果表明，7 個跨膜螺旋區同源性較高，其他部分序列差異較大。本研究獲得的鯉ffar3基因蛋白序列與斑馬魚的序列相似性最高，同源性達94.19%；與人類、小鼠、半滑舌鰨、虹鱒、斑點叉尾、牙鲆、大刺鰍及青鳉等物種相似性差異不大，同源性介于70.37%～78.46%之間；與鯨和江豚相似性最低，分別為65.99%和66.41%。除去四種哺乳動物（人、小鼠、鯨和江豚），其他魚類之間氨基酸序列的多重比對結果表明，少數幾個相似性在80%以上，其他均介于66%～80%之間，物種間相似度相差不大（表2）。

圖1 鯉ffar3 基因的DNA 全長序列及氨基酸推導序列Fig.1 The full-length DNA and deduced amino acids of ffar3 in common carp Cyprinus carpio

基于9 種硬骨魚類、8 種哺乳動物、雞及非洲爪蟾等19 個ffar3 的氨基酸序列，用羅非魚ffar2 基因作為外類群（outgroup），使用MEGA 6.0 軟件構建ffar3 基因的系統進化樹（圖3）。由圖3 可知，所有硬骨魚類ffar3 基因與哺乳動物的ffar3 基因分屬于系統進化樹的2 個分支。硬骨魚類分支中，不同物種形成兩個亞支。鯉ffar3 基因聚在斑馬魚、劍尾魚、半滑舌鰨和斑點叉尾的ffar3 基因的分支中，而鯉和斑馬魚ffar3 基因親緣關系最近，聚在一起。牙鲆、青鳉和大刺鰍聚在一起。雞和非洲爪蟾的ffar3 基因單獨呈一支。

圖2 ffar3 基因編碼蛋白的二級結構Fig.2 Secondary structure of protein deduced by the ffar3 gene

2.3 鯉ffar3 基因的組織表達分析

熒光定量RT-PCR 結果顯示，攝食后鯉腦、腸和肌肉中ffar3 基因mRNA 表達水平均有顯著變化，而肝臟中變化不顯著；鯉攝食2 h 時，該基因在腦中表達量最高，在進食后6 h 時小腸中表達量最高。縱觀四種組織，ffar3 基因在腸組織中表達量最高，肌肉和腦次之，而在肝表達量最小。基因表達量差異顯著的三種組織在進食后不同時間表達量差異顯著。腦組織中，進食2 h 時基因表達量最高，隨著時間的推移，4 h 和6 h 基因表達量遞減。而腸和肌肉中，進食后2～6 h 基因表達量升高，在6 h 時表達量最高。在肌肉中的情況與腸相似，也是隨著進食時間的推移，表達量上升，只是表達量升高的幅度較腸小（圖4）。

表2 魚類和其他物種FFAR3 氨基酸序列比對（%）Tab.2 Comparison of the identities and divergence of the FFAR3 amino acid sequences between the fish and other species

圖3 鯉ffar3 氨基酸進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of deduced amino acid sequence of the ffar3 gene in common carp Cyprinus carpio

圖4 ffar3 基因在鯉不同組織中的mRNA 表達水平Fig.4 Expression levels of mRNA ffar3 gene in different tissues of common carp Cyprinus carpio

3 討論

自由脂肪酸受體FFAR3 也被稱為G 蛋白偶聯受體（G protein-Coupled Receptor 41，GPR41），首先被發現于動物腸道中[23,24]。營養物質吸收調控的關鍵步驟是營養物質的感知，G 蛋白偶聯受體FFAR3具有這一功能。FFAR3 為脂肪酸感受器，可以感知來自消化腔的短鏈脂肪酸，如乙酸、丙酸和丁酸等，由腸道微生物發酵膳食纖維和前腸未消化的碳水化合物生成，是動物體內一種重要的能量來源[25]。FFAR3 作為一種重要的信號分子可調控脂類代謝、腸道對營養物質的吸收以及與細胞的分化和增殖密切相關的生理過程[23-25]。Samuel 等[25]研究表明：ffar3 基因敲除,小鼠腸道食糜通過腸道時間延長，短鏈脂肪酸吸收減少。Solima 等[26]的研究發現，敲除ffar3 基因后，短鏈脂肪酸減少，采食量和能量消耗增加，體重減輕。一些研究還發現，ffar3 基因具有調節機體內脂肪形成的作用。Meza-Cuenca 等[27]發現，肥胖大鼠腹部脂肪細胞中ffar3 基因的mRNA 的表達量較對照組顯著增加，說明其在脂肪形成過程中發揮重要作用。Zaibi 等[28]在小鼠中也得出了相似的結論。

近年來，ffar3 基因的功能在家畜中也有一些研究報道。Inoue 等[29]研究發現，FFAR3 等短鏈脂肪酸能為反芻動物提供75%的能量，可激活FFAR3 調節脂肪代謝。郝軍等[30]在研究牦牛ffar3 基因對生長性狀的關聯時發現，ffar3 基因不同基因型對牦牛體質量和體高有顯著作用。李根來等[31]研究表明，豬ffar3 在不同組織、不同發育階段表達量呈明顯的時間特異性，揭示其可能在不同發育階段和不同組織中發揮重要的生理功能。在家畜中，還有較多研究集中在組織表達特異性方面[32-35]。

但ffar3 基因在魚類中尚未見報道。本研究通過前期高密度遺傳連鎖圖譜精細定位獲得的候選基因，定位了ffar3 為食物轉化率相關的候選基因，通過鯉全基因組物理圖譜和轉錄組圖譜獲得了該基因的全長序列。鯉ffar3 基因全長序列為3 318 bp，具有一個長度為990 bp 的完整開放式閱讀框（457～1 446 bp），編碼329 個氨基酸，與斑馬魚（編碼327 個氨基酸）、斑點叉尾（編碼325 個氨基酸）、牙鲆（編碼325 個氨基酸）等基本一致，可判斷其cDNA 的完整性。多個物種的氨基酸同源性分析表明，鯉ffar3 基因與其他魚類同源性較高，其中與斑馬魚ffar3 基因的同源性最高，達94.19%。尤其是7 個跨膜螺旋區域同源性更高，表明ffar3 基因相對保守，這與Wang 等[36]的研究結果一致。系統進化分析結果顯示，魚類ffar3 基因親緣關系較近，所有硬骨魚類ffar3 基因聚在一支，而哺乳動物則聚在另一支。

本文通過實時熒光定量PCR 分析，檢測到鯉ffar3在腦、腸、肌肉和肝臟中均有表達，腸中表達量最高，這與前人在ffar3 在人[36]、豬[31]、山羊[34]和奶牛[38]等組織的表達結果一致。本研究還發現，隨著進食后時間的不同，除了肝臟外，其他三種組織mRNA表達水平呈現明顯差異。腦中在進食后2 h 基因表達量達到最高值，隨后在進食后4 h 和6 h 呈下降趨勢。而在腸中則隨著進食時間的延遲，基因表達量逐漸升高，在進食6 h 達到最高。肌肉的表達趨勢與腸一致，但基因表達量升高的幅度小于腸組織。這些結果表明：ffar3 基因與攝食相關，暗示該基因可能參與了食物轉化和吸收相關的生理過程。本研究僅在四種組織中探究了基因的表達情況，還需在多種組織中進一步驗證。由于食物轉化率性狀是一個多基因控制的性狀，單獨研究一個基因還遠遠不夠，需要不斷挖掘更多的相關候選基因來分析表達差異，建立起基因功能的調控網絡，以用于提高魚的食物轉化效率，促進魚類快速生長。