Purmorphamine對腦缺血再灌注大鼠細胞凋亡影響的實驗研究

朱美霖，白宏英

(1.山東省濟寧市第一人民醫院老年醫學科，山東 濟寧 272000；2.鄭州大學第二附屬醫院神經內科，河南 鄭州 450000)

腦缺血性疾病是一種高發性、高致死率的嚴重影響人類健康的一種疾病。近年來我國腦缺血性疾病的致死率位居首位[1]。腦缺血再灌注損傷一直是研究的熱點，腦缺血再灌注機制包括炎癥、氧化應激、細胞凋亡、鈣超載、能量障礙等多種因素。腦缺血時可激活凋亡蛋白的表達，引起腦細胞的凋亡，盡早進行抗細胞凋亡治療是減少神經損傷的重要一環。在細胞凋亡過程中B淋巴細胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2)、Bcl-2相關X蛋白(BCL2-Associated X)與細胞凋亡有著密切關系，其中Bcl-2對腦細胞凋亡起到抑制作用，而Bax對細胞凋亡具有促進作用[2]。Purmorphamine(PM)是一種無毒性小分子的嘌呤衍生物，可以激活Sonic Hedgehog信號通路。有研究表明PM可以透過血腦屏障，在神經系統疾病中發揮抗炎作用，而在蛛網膜下腔出血中具有神經保護作用[3]。目前對于PM對腦缺血再灌注大鼠模型細胞凋亡的影響研究甚少，因此本次研究就此問題進行初步探討。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物及分組：選取健康成年雄性SD大鼠75只，體重約220～250 g。將大鼠隨機分為假手術組、模型組、PM低劑量組、PM中劑量組、PM高劑量組五組，各組15只大鼠。PM低劑量組于術后給于5 mg/kg腹腔注射Purmorphamin溶液，PM中劑量組于術后給予10 mg/kg腹腔注射Purmorphamine溶液，PM高劑量組給予20 mg/kg腹腔注射Purmorphamin溶液。模型組及假手術組給予DMSO溶液腹腔注射。

1.1.2 材料：Purmorphamine粉劑購于上海凱試公司，DMSO購自美國Sigma公司，D-140圖像記錄分析系統(大連競邁儀器有限公司)、微型離心機(珠海黑馬醫學儀器有限公司)、抗Bcl-2抗體Santacruz、Sc23960GAPDH抗體、ABCAMAb8245抗Bax抗體Santacruz、ECL試劑盒購于北京中山、0412-31二抗(Zymed公司)、SK-30高速冷凍離心機購于美國SIGMA公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型制備及給藥：采用Longa等[4]改良的線栓法制備大鼠大腦中動脈腦缺血再灌注損傷模型。大鼠給予10%水合氯醛腹腔注射麻醉，備皮消毒后切開頸部皮膚，鈍性分離周圍組織，暴露并分離左側頸總動脈、頸內動脈、頸外動脈，結扎頸外動脈，動脈夾暫時夾閉頸內動脈及頸總動脈。在距離頸總動脈分叉處0.4 cm處剪出小口，插入制備好的線栓，松開動脈夾，使線栓進入顱內，插入深度約17～19 cm保證大腦中動脈血流被阻斷。固定線栓，2 min后拔出線栓縫合皮膚。假手術組僅分離頸總動脈及分支，并不給予其余處理。PM低劑量組、PM中劑量組、PM高劑量組分別按既定的5、10、20 mg/kg的劑量給予腹腔注射配備好的Purmorphamine溶液，假手術組及模型組給予同等劑量的DMSO溶液腹腔注射。術后大鼠保溫蘇醒后單籠飼養，室溫保持在20～30 ℃。

1.2.2 神經功能缺損評分：大鼠清醒后采用Longa[4]5分制作為評分標準。0分：完全無神經缺損癥狀。1分：輕度運動障礙，右前爪曲屈狀態。2分：中度運動障礙，行走時右轉彎。3分：行走向右傾倒無法保持平衡。4分：出現意識障礙。其中1～3分視為造模成功納入實驗分組。

1.2.3 TTC測大腦梗死面積：各組大鼠隨機選取5只麻醉后斷頭取出腦組織，將腦組織放在-20 ℃冰箱內冰凍20 min。取出腦組織沿冠狀面切成約2 mm的切片，并將切片放置于2% TTC的PBS緩沖液中于37 ℃避光培養30 min，取出切片4%甲醛溶液固定，腦梗死組呈紅色，正常腦組織呈白色，采用圖像分析系統測定梗死腦組織面積，并計算腦梗死體積比值。

1.2.4 采用原位TUNEL方法檢測腦缺血區細胞凋亡情況：根據TUNEL試劑盒說明書進行操作，切片經過二甲苯脫蠟、梯度乙醇水合，蛋白酶K溶液去除組織蛋白，PBS漂洗后樣本中加入TUNEL反應液50 μl，37 ℃下反應50 min，PBS漂洗后加入DAB顯色液50 μl，隨后蘇木精復染，脫水、透明、封片。光鏡下隨機選取五個視野觀察凋亡細胞素，其中細胞核呈濃縮棕黃色顆粒為凋亡陽性細胞，多見于梗死腦組織周圍，取平均值計算陽性細胞數。凋亡率=(凋亡細胞數/細胞總數)×100%。

1.2.5 Western blot 分析Bcl、Bax的表達：組織剪切成小塊，加入蛋白裂解液進行裂解。14000 g離心5 min，取上清。5%濃縮、10%分離膠溶液的制備和灌注、將樣品稀釋到相同的濃度，體積為20 μl，加入4 μl上樣緩沖液，混勻后在沸水浴中煮沸5 min。泳道中加入8 μl蛋白質Marker，在其余泳道中把樣品全部加入到泳道中。穩壓80 V，當溴酚藍指示劑遷移到濃縮膠與分離膠的界面時，調整電壓到100 V，穩壓電泳，直至溴酚藍指示劑遷移到分離膠下緣時，停止電泳，轉膜、封閉。將一抗按1∶1000稀釋，4 ℃搖床低速搖動過夜孵育。洗脫緩沖液洗滌3次，時間分別為15、10、5 min。第二抗體為羊抗兔，按1∶4000稀釋，置于37 ℃恒溫搖床上，低速搖動孵育45 min。洗脫緩沖液洗滌3次，每次5 min。在暗室中，滴加1×顯影液和定影液分別倒入瓷盤中，定影5～10 min，至膠片透明為止；用自來水沖去殘留的定影液，室溫晾干。拍照備用。膠片掃描后用Bandscan 5.0軟件進行灰度分析。

2 結 果

2.1 各組大鼠神經缺損評估及腦梗死體積比較 模型組大鼠神經功能缺損評分與假手術組相比較明顯升高，梗死體積比明顯增大(P<0.05)。藥物組(PM低劑量組、PM中劑量組、PM高劑量組)與模型組相比較神經功能缺損評分明顯降低，腦梗死體積比明顯降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠神經功能缺損評估及腦梗死體積比較

2.2 各組細胞凋亡率比較 模型組大鼠腦細胞凋亡率與假手術組相比較明顯升高(P<0.01)，藥物組腦細胞凋亡率與模型組凋亡率明顯下降，其中PM高劑量組凋亡率下降最為顯著(P<0.01)。見表2。

表2 各組細胞凋亡率比較(%)

2.3 各組Western blot檢測Bcl-2、Bax的表達 假手術組可見極少量蛋白表達。模型組與假手術組相比較，Bcl-2蛋白的表達明顯增多，差異具有統計學意義(P<0.05)。給藥組與模型組相比較，Bcl-2表達明顯增多，其中PM高劑量組的增多最為顯著，差異具有統計學意義(P<0.05)。Bax蛋白表達在假手術組中少見，模型組與假手術組相比較Bax蛋白表達明顯增多，差異具有統計學意義。PM低劑量組、PM中劑量組、PM高劑量組較模型組相比較Bax的表達明顯下降，其中PM高劑量組Bax表達下降最為顯著，差異具有統計學意義(P<0.05)。見表3、圖1。

表3 各組Bcl-2、Bax的表達

圖1 Western Blot檢測Bcl-2、Bax的表達

3 討 論

腦缺血再灌注是一個涉及到鈣超載、炎癥反應，細胞凋亡、自由基損傷等一系列復雜的級聯反應，細胞凋亡是其中一個極其重要的病理生理機制[5-6]。細胞凋亡是細胞程序化、自主化死亡的復雜過程，該過程由多種調節基因共同調控完成。某些生理或病理因素誘導下激活膜信號系統，啟動有關調控細胞凋亡的程序基因，最終導致細胞按一定程度控制自我破壞和死亡[7]。在眾多調控基因中Bcl家族基因家族在細胞凋亡中發揮著重要的作用。Bcl-2蛋白和Bax蛋白是目前Bcl家族中研究比較廣泛深入的基因。促凋基因Bax和抑凋基因Bcl-2家族具有同源性[8]，Bcl-2 蛋白和Bax蛋白是線粒體外膜上一對相互拮抗的細胞凋亡因子，有研究表明Bcl-2蛋白和Bax蛋白是抑制和促進細胞凋亡的最重要基因[9-10]。Bcl-2蛋白是一種抗凋亡蛋白，可以通過抑制Bax蛋白的轉位，保護線粒體電勢梯度，調節鈣離子的自穩狀態，抑制氧自由基的產生，從而抑制凋亡途徑[11]。因此Bcl-2蛋白常作為對細胞凋亡進行研究的觀察指標。Bax蛋白是一種促凋亡蛋白，不但起到拮抗Bax蛋白的作用，而且有直接促進細胞凋亡的作用。Bcl蛋白和Bax蛋白之間的平衡影響細胞凋亡的發生。因此本次研究選取Bcl蛋白和Bax蛋白作為觀察細胞凋亡的指標，以探究 Purmorphamine在對腦缺血再灌注細胞凋亡的影響。

Purmorphamine是一種分子量為520.62的小分子嘌呤衍生物，可與SHH信號通路中SMO蛋白結合從而激活SHH信號通路[ 12]。Purmorphamine與腦缺血性疾病關系密切[13]。Purmorphamine可以激活SHH信號通路促進腦缺血大鼠的血管再生，也可促進腦缺血神經元修復。Chechneva[14]研究表明Purmorphamine在腦缺血中可使血腦屏障通透性下降以及受損神經元組織型纖溶酶原激活物短暫上調，從而發揮神經保護作用。此外，Purmorphamine可以提高海馬神經元抵抗能力，通過抗氧化來保護海馬神經元，從而減少神經元死亡[15]。在本次研究中，我們發現Purmorphamine可以減輕腦缺血再灌注后的腦梗死面積，同時可以抑制神經細胞的凋亡。

本研究顯示在大鼠腦缺血再灌注模型組6 h后Bax較假手術組明顯上調，而Bcl-2較假手術組明顯下降，這提示Bax和Bcl-2參與腦缺血再灌注后細胞凋亡的調控，這與之前研究相符合。而PM組與模型組相比較，Bax的表達下調，Bcl-2的表達明顯上調，這表明Purmorphamine可以通過抑制Bax的表達，上調Bcl-2的表達，從而抑制細胞凋亡，減輕腦缺血后腦損傷。PM高劑量組與其他劑量組相比較，對Bax的表達下調及Bcl-2表達上調的作用更為顯著。這表明Purmorphamine對細胞凋亡的影響與劑量呈正相關。本研究仍有大量不足。對于Purmorphamine調控Bax和Bcl-的表達的具體機制，是否與SHH信號通路被激活有關等相關問題仍需進一步深入研究。