5-氟尿嘧啶區域動脈灌注對SAP大鼠細胞凋亡的影響

張旭升，李曉娟

(甘肅省第二人民醫院：1.普外科；2.內分泌科，甘肅 蘭州 730000)

急性重癥胰腺炎(SAP)屬普外科常見急腹癥，常因膽總管結石嵌頓或Oddish括約肌痙攣所致。約20%的急性胰腺炎患者可進展為SAP，若不及時干預還可引發全身炎癥反應綜合征等[1-2]。以往多采用手術清除壞死組織治療SAP，但開腹手術較難徹底清除胰腺及胰周壞死組織，且可能引發內環境紊亂，增加發生大出血、腹腔感染等并發癥的風險[3]。故近年來，臨床多推薦給予非手術治療。有研究證實，區域動脈灌注在SAP治療中效果較理想，可經胰腺病變部位供血動脈置入導管，通過導管輸注治療藥物，使胰腺局部藥物濃度提升，達到治療的目的[4]。但國內就SAP區域動脈灌注治療的相關研究仍較少，特別是對胰腺腺泡細胞凋亡分析的相關研究較少，且受實驗性模型動物血管分離難度大、臨床影像學支持不夠等因素影響，仍缺乏合理、規范的實驗性區域動脈灌注模型。此外，動脈藥物選擇也是影響SAP區域動脈灌注治療的關鍵。5-氟尿嘧啶(5-FU)屬常用抗代謝藥物，可抑制SAP時的高炎性細胞因子血癥，通過抑制免疫過激的方式緩解SAP的病理生理學異常，達到治療的目的。但5-FU常規全身靜脈給藥具有一定的毒性[5]。本研究創建了SAP大鼠模型，重點分析了5-FU區域動脈灌注對大鼠細胞凋亡的影響，現報道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1一般材料 2019年10月選取健康成年雄性SD大鼠(甘肅中醫藥大學SPF實驗動物中心提供)24只，體重252～305 g，平均(285.60±5.55)g。本研究已獲得本院倫理委員會審核批準。

1.1.2儀器與試劑 儀器包括600E-2487系列高效液相色譜儀(美國Waters公司)、Fresco 21超高速離心機(德國Thermo公司)、全自動生化儀(美國貝克曼庫爾特公司)、全自動酶標儀EL×800(廈門寶特科技有限公司)、顯微鏡[奧林巴斯(日本)有限公司]等。試劑包括5-FU注射液(上海旭東海普藥業有限公司，國藥準字H31020593)、5-FU標準品(美國Sigma公司)、酶聯免疫吸附試劑盒(上海西唐生物科技有限公司)、蘇木精-伊紅(HE)染色液(北京索萊寶科技有限公司)、原位末端標記法凋亡檢測試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)等。

1.2方法

1.2.1SAP模型創建與分組 24只大鼠均采用逆行胰膽管注射法創建SAP模型。術前禁食12 h，可自由飲水。給予10%水合氯醛3 mL/kg進行麻醉。取上腹正中切口，自劍突下1.0 cm向下剪開1.5～2.0 cm切口。經腹白線剪開肌肉，注意保護肝臟。以拉鉤打開兩邊皮膚、肌肉，暴露內臟。探查胰十二指腸，十二指腸翻開拉向左側，暴露脂肪狀胰腺。肝臟內稍傾斜乳白色管狀結構即為胰膽管。逆行胰膽管，以5%牛磺膽酸鈉微泵泵入，創建SAP模型。術畢連續縫合皮膚、肌肉組織。術后常規保暖，禁食，不禁飲。編號后采用隨機數法抽樣分為A組、B組和C組，每組8只。A組創建SAP模型后不給予 5-FU；B組創建SAP模型后經股靜脈輸注5-FU 10 mg/kg，采用0.1 mL肝素鈉生理鹽水封管，防止穿刺針內殘留藥物；C組創建SAP模型后于10倍手術顯微鏡指導下區域動脈灌注5-FU 10 mg/kg，主要自肝固有動脈插管，直至胰十二指腸動脈，經導管給藥。術后縫合皮膚及皮下組織。

1.2.2血清淀粉酶、脂肪酶檢測 給藥后6 h股動脈采血，取血清標本，檢測血清淀粉酶、脂肪酶等。

1.2.3胰腺HE染色 采用頸椎脫臼法處死大鼠，開腹取1.0 cm×1.0 cm胰腺組織，厚度盡量薄，以增大接觸面積。標本固定于4%多聚甲醛中。用自來水洗滌10 min，脫水：75%乙醇持續1 h，85%乙醇持續1 h，95%乙醇持續1 h，95%乙醇持續1 h，無水乙醇持續30 min。透明：二甲苯Ⅰ持續30 min，二甲苯Ⅱ持續30 min，注意觀察組織形態。常規浸蠟，包埋，置于-20 ℃冰箱內過夜。蠟塊切片，厚度10 μm切齊整，4 μm細切。48 ℃撈片，置入68 ℃紅烤箱持續2 h。合理控制烤片時間，防止烤片過短引發脫片，烤片過久致使脫蠟時間延長。常規脫蠟，蘇木精染色10 min，用自來水洗滌10 min。觀察充分返藍后伊紅染色25 s。中性樹膠封片，顯微鏡下觀察、拍片。采用原位末端標記法檢測胰腺腺泡細胞凋亡率，嚴格按試劑盒說明書進行操作。陽性標準：細胞核內存在黃色顆粒。在光鏡下計算胰腺腺泡細胞凋亡指數，計數高倍鏡(400×)下500個細胞，計算凋亡細胞、總細胞數。凋亡指數=凋亡細胞數/總細胞數×100%。

1.2.4胰腺病理評分 取胰腺標本，石蠟切片，HE染色，參照文獻[6]進行胰腺病理評分，由2名經驗豐富的病理科醫師采用雙盲法評估，包括胰腺間質水腫、腺泡細胞壞死、炎癥細胞浸潤、出血、脂肪壞死等，各項由輕至重以0～4分表示。

2 結 果

2.1胰腺組織光鏡觀察 3組大鼠胰腺腺體結構均紊亂，部分腺泡組織空泡化，胰腺間質水腫，存在炎癥細胞浸潤。C組大鼠胰腺炎癥細胞浸潤、腺泡細胞空泡化、胰腺間質水腫明顯較B組減輕。見圖1。

短箭頭：炎癥細胞浸潤；長箭頭：胰腺腺泡細胞空泡化。

2.23組大鼠血清淀粉酶、脂肪酶水平比較 B、C組大鼠血清淀粉酶、脂肪酶水平均明顯低于A組，且C組大鼠血清淀粉酶、脂肪酶水平均明顯低于B組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 3組大鼠血清淀粉酶、脂肪酶水平比較

2.33組大鼠胰腺細胞凋亡指數、胰腺病理評分比較 B、C組大鼠胰腺細胞凋亡指數、胰腺病理評分均明顯低于A組，且C組大鼠胰腺細胞凋亡指數、胰腺病理評分均明顯低于B組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 3組大鼠胰腺細胞凋亡指數、胰腺病理評分比較

3 討 論

當前，尚未具體明確急性胰腺炎的發病機制，考慮與腸道細菌易位、炎癥、胰腺腺泡內鈣超載、細胞凋亡等因素有關[7]。有研究表明，SAP的發生、發展與炎癥應激關聯較大。炎癥應激還可造成患者自身組織、器官損傷，導致SAP患者出現免疫損傷，影響T淋巴細胞免疫功能。此外，有研究發現，在急性胰腺炎發生、發展中，胰腺腺泡細胞凋亡發揮了重要作用[8-9]。目前，區域動脈灌注作為SAP非手術治療手段已用于臨床，可經由區域動脈灌注給藥方式促使胰腺組織藥物濃度提升，增強療效[10]。但就SAP區域動脈灌注藥物的選擇仍存在較大爭議，而灌注藥物組合方案選擇對療效具有直接影響。

有研究證實，5-FU可干擾DNA、RNA合成，控制胰腺腺泡細胞合成，抑制胰淀粉酶、胰蛋白酶的釋放，還具有控制某些炎癥介質的作用，減輕炎性反應[11]。李強等[12]研究表明，SAP大鼠經5-FU區域動脈灌注可減輕肺損傷，該作用機制與抑制促炎性細胞因子過度表達有關，但其未就胰腺細胞凋亡進行深入分析。本研究中B、C組分別采用5-FU外周靜脈輸注、區域動脈灌注途徑給藥，結果顯示，B、C組大鼠胰腺細胞凋亡指數、胰腺病理評分均較A組低，差異均有統計學意義(P<0.05)。分析與5-FU本身作用機制有關，其可被細胞攝取，并進一步代謝成為幾種活性代謝產物，抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶活性，且能直接對DNA鏈延長產生作用，促使DNA穩定性出現變化，DNA斷裂，抑制細胞凋亡，達到減輕胰腺炎癥病理程度的目的。本研究結果還顯示，與B組比較，C組大鼠胰腺細胞凋亡指數、胰腺病理評分均更低，差異均有統計學意義(P<0.05)，提示5-FU區域動脈灌注途徑給藥在抑制胰腺細胞凋亡、控制病情方面的價值較5-FU外周靜脈血管途徑給藥更佳。分析其原因，可能是因為5-FU區域動脈灌注可提升胰腺組織內5-FU藥物濃度，促使藥效的充分發揮，避免了出現外周靜脈途徑給藥所致5-FU較難進入胰腺組織、全身體液免疫抑制等問題。葉樂馳等[13]創建了SAP大鼠模型，并實施5-FU區域動脈灌注，結果同樣證實胰腺腺泡細胞凋亡被明顯抑制，認為是改善急性胰腺炎的重要機制。此外，血清淀粉酶、脂肪酶與胰腺炎的發生關聯較大[14-16]。血清淀粉酶主要分泌自唾液腺、胰腺等，可分解多糖，其檢測指標在急性胰腺炎的診療中判斷疾病嚴重程度方面發揮著重要作用。而脂肪酶為胰腺外分泌酶，正常時為消化酶的一種，進入主胰管流入十二指腸參與消化，但胰腺細胞被免疫因子破壞崩解后便釋放入血，故血清脂肪酶水平取決于細胞崩解率，因此，檢測脂肪酶水平可判斷SAP患者的預后。本研究結果顯示，B、C組大鼠血清淀粉酶、脂肪酶水平均明顯低于A組，且C組大鼠血清淀粉酶、脂肪酶水平均明顯低于B組，差異均有統計學意義(P<0.05)。

綜上所述，SAP大鼠模型經5-FU區域動脈灌注可明顯抑制胰腺細胞凋亡，控制血清淀粉酶、脂肪酶水平，減輕病理改變程度，需引起高度關注。