酒酒球菌在葡萄酒中的應用研究進展

侯冬冬，劉朋，趙祥忠，姚艷艷，何熹*

（1.齊魯工業大學（山東省科學院）生物工程學院，山東 濟南 250353；2.國家海產貝類工程技術研究中心，山東 威海 264316）

葡萄酒的釀造是一個復雜的過程，涉及不同微生物的相互作用，其中主要包括釀酒酵母和乳酸菌。釀酒酵母主要負責酒精發酵，可以將葡萄汁中的糖轉化為酒精和CO2，是葡萄酒香氣物質形成的主要時期[1]。蘋果酸-乳酸發酵通常在酒精發酵期間或酒精發酵結束時進行，由一種或多種乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）啟動并進行[2]。其能夠降低葡萄酒的酸度，并且有利于提高微生物的穩定，乳酸菌的次級代謝產物還能夠極大地豐富葡萄酒的香氣，提高感官特性[3-4]。在所有乳酸菌品種中，酒酒球菌既能適應惡劣的葡萄酒環境，又能通過蘋果酸-乳酸發酵改善葡萄酒口感，因此是商業葡萄酒發酵劑的代表菌株。

由于酒酒球菌在葡萄酒釀造中的重要地位，越來越多的研究者對酒酒球菌做了相關研究。在研究初期，通過對我國葡萄酒主產區的乳酸菌進行分離和鑒定，從中篩選出了釀酒適應性和釀酒特性優良的菌株[5]。進一步研究發現，酒酒球菌能夠在復雜的葡萄酒環境中生存，其產生的次級代謝物能夠提高葡萄酒的品質和改善風味[6]。雖然酒酒球菌能夠耐受環境中葡萄酒發酵中的乙醇、SO2等不利條件，但是葡萄酒中存在的各種因素，都有可能制約著酒酒球菌的生長繁殖和代謝[7]。全面認識酒酒球菌在葡萄酒釀造中的作用有利于更好地調控葡萄酒蘋乳發酵，從而進一步提高其在葡萄酒釀造中的應用。

1 酒酒球菌的分離篩選和鑒定

在葡萄酒釀造中啟動并參與蘋果酸-乳酸發酵（簡稱蘋乳發酵）的乳酸菌被稱為葡萄酒乳酸菌，目前研究結果發現主要有4個屬，分別為乳桿菌屬（Lactobacillus beijerinck）、明串珠球菌屬（Leuconostoe mesenteroides）、片球菌屬（Pediococcus blaussen）以及酒球菌屬（Oenococcus）[5]。在所有的蘋乳發酵菌株中，酒酒球菌表現出優良的釀酒風味特性，對提升葡萄酒品質有著積極作用，因此商業乳酸菌主要以酒酒球菌為主導者。植物乳桿菌也是發酵過程中一種常見的菌種，可以作為蘋乳發酵的啟動菌。有相關研究表明植物乳桿菌會在蘋乳發酵過程中產生生物胺等不良次級代謝物，使酒產生鼠臭味影響葡萄酒的品質和香氣[8]。因此，分離篩選和鑒定出具有優良釀酒適應性和釀酒特性的酒酒球菌，對于提高葡萄酒二次發酵品質具有重大意義。

1.1 酒酒球菌的分離篩選

酒酒球菌是一種營養缺陷型菌株，絕大多數菌株缺乏煙酰胺腺嘌呤二核苷酸-葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，需要在添加番茄汁生長因子的培養基中才能夠生長[5]。目前我們所采用的酒酒球菌分離培養基為番茄汁培養基。為了提高酒酒球菌的鑒別能力，一般還會添加放線菌酮50 mg/L、萬古霉素50 mg/L（放線菌酮能有效地抑制酵母菌和霉菌的生長，萬古霉素能夠抑制其他乳酸菌）。通過添加這兩種抗生素，可以分離得到原存在于葡萄酒中的酒酒球菌[9-10]。

1.2 酒酒球菌的鑒定

對分離得到的酒酒球菌一般會先采用生化鑒定，主要從菌株的形態特征（細胞球型至橢圓型，常成對和鏈形排列，直徑通常小于1 μm）、生理生化特征（革蘭氏陽性菌，能夠分解蘋果酸）等方面進行分類區別[11]。生化鑒定法作為一種基礎鑒定方法，雖然操作簡單，但過程會相對復雜，耗時長，結果也會有差異性。隨著科學技術不斷發展，分子技術不斷推陳出新，特別是在物種鑒定方面，逐漸形成快速準確的方法。目前的分子鑒定方法一般為16SrRNA、分子標記、擴增核糖體DNA限制性分析和多位點序列分析[12]。我國葡萄種植和葡萄酒釀造地域性差距大，分離篩選和鑒定出本土優質的酒酒球菌菌種，對我國葡萄酒產業發展具有推動作用。

2 酒酒球菌對葡萄酒釀造的作用

酒酒球菌是目前公認的能夠較快適應葡萄酒酒精發酵之后惡劣環境的一類乳酸菌，如低pH值、高SO2濃度和高乙醇體積分數[13]，能夠對葡萄酒蘋乳發酵起到啟動和執行的作用。蘋乳發酵主要指葡萄酒中蘋果酸通過酒酒球菌作用轉化為乳酸的過程。在此過程中能夠提高葡萄酒pH值，一般被認為是葡萄酒的生物降酸過程[14]。此外，酒酒球菌在發酵過程中還會產生許多次級代謝物，一部分為自身的生長和繁殖提供能量和營養，另一部分能在一定程度上賦予葡萄酒豐富的香氣[5]。此過程對于提高葡萄酒品質的意義在于提高葡萄酒生物穩定性、降低色度、增加香氣復雜度、提高葡萄酒品質和改善口感[15]。

2.1 提高葡萄酒生物穩定性

葡萄酒是葡萄汁經過發酵形成的產物。酵母通過酒精發酵將絕大多數的營養物質消耗掉，這一過程會產生大量有機酸，其中蘋果酸容易被多種微生物利用，因而會使葡萄酒在貯存過程中腐敗。在蘋乳發酵過程中，酒酒球菌對蘋果酸具有獨特的分解作用，同時也會消耗其他營養物質，從而減少其他有害微生物的產生，經過這一過程，可以提高葡萄酒生物穩定性，有益于延長葡萄酒貯存時間[16]。

2.2 降低葡萄酒色度

葡萄酒的顏色是判斷葡萄酒品質的一個重要標準，其顏色的形成主要與葡萄品種和陳釀有關，主要成分為花色苷。參與蘋乳發酵的酒酒球菌可以利用與SO2結合的物質如α-酮戊二酸、丙酮酸等，可以釋放出SO2[17]。處于游離狀態的SO2可以與花色苷結合，從而減少葡萄酒中的顯色物質[18]，經過這一過程可以使葡萄酒的顏色更加具有觀賞性。

2.3 增加葡萄酒香氣復雜度

隨著葡萄酒酸度的降低，會使酒的口味變得柔和圓潤。酒酒球菌在將蘋果酸轉化為乳酸的同時也會產生一些次級代謝物，比如雙乙酰、乙偶姻、2，3-丁二醇及其它優良的風味物質，這些都是對葡萄酒有利的物質，能夠增加葡萄酒香氣的豐滿性和復雜度[19]。

2.4 提高葡萄酒品質改善口感

酸類物質是葡萄酒的主要成分，其組成和含量直接和間接影響著葡萄酒的品質[20]。葡萄酒中的有機酸主要是蘋果酸和酒石酸，其中蘋果酸給人的感官特征為尖銳且帶有澀感，不太容易被人接受[21]。經過酒酒球菌轉化為乳酸，乳酸口感柔和順口，沒有澀感[22]。因此，能夠在提高葡萄酒品質的同時改善口感，讓更多的人群接受。這使得酒酒球菌在葡萄酒后期香氣形成中有著獨特的作用。

2.5 酒酒球菌可能引起的潛在質量風險

相關研究表明，當葡萄酒蘋乳發酵結束后不立即采取中止措施，酒酒球菌可會轉化為病原菌，引發葡萄酒病害，如酒石酸發酵病、乳酸發酵病、乳酸性酸敗等[23]。因此在進行蘋乳發酵時，檢測蘋果酸和乳酸的含量是十分有必要的，嚴格的工藝流程也是生產出優質葡萄酒的先決條件。

3 葡萄酒釀造過程對酒酒球菌的影響

酒酒球菌獨特的釀酒特性會影響其生長的環境，即對葡萄酒品質的影響[12]。而在這一過程中，葡萄酒的自身環境同樣是制約著酒酒球菌的生長的關鍵因素。除此之外，不同的釀酒工藝，如酒酒球菌不同的接種量和接種時間也會影響其生長。酒精發酵后殘留的酵母菌，以及其他乳酸菌菌群，彼此之間的相互作用同樣會對酒酒球菌有影響[24]。

3.1 環境因素對酒酒球菌的影響

酒精發酵結束后，葡萄酒處于比較惡劣的環境：低pH值、高酒精度、高SO2濃度等，這些因素很大程度上影響了酒酒球菌的生存和生長[25-26]。pH值越低，對酒酒球菌的抑制效果越明顯，會阻礙蘋乳發酵的啟動。酒精是酒酒球菌在葡萄酒中生長的主要抑制因子，高含量乙醇能影響細胞膜流動性，會阻礙酒酒球菌生長[27]。溶解氧不僅不利于酒酒球菌生長，還會使醋酸菌等有害微生物大量繁殖，乙酸、雙乙酰等不良產物含量上升，使葡萄酒敗壞[28]。SO2在葡萄酒釀造過程中起到抗氧化、抑制野生酵母和腐敗菌生長的作用，但它對酒酒球菌也會有一定的抑制作用，當濃度大于100 mg/L時，酒酒球菌將會完全被抑制，無法生長[29]。研究表明：酒酒球菌能夠在pH值不低于3.2、酒精度10%vol～14%vol、總SO2濃度不超過50 mg/L條件下正常生長[26]。

3.2 不同接種量和接種時間的影響

酒酒球菌不同的接種量會影響蘋乳發酵的速度，從而影響葡萄酒中揮發酸的含量和葡萄酒的色澤。不同的酒酒球菌發酵特性不同，在使用前應進行接種量試驗，選擇最佳接種量有利于蘋乳發酵的順利進行[30]。同時接種時間對蘋乳發酵的啟動和保持菌種活性同樣重要。通常有以下3種接種時間安排：混合接種（在酒精發酵啟動時與酵母同時接種），過程接種（在酒精發酵過程中接種），順序接種（酒精發酵結束后接種），接種時間會影響接種后酒酒球菌的成活率和延滯期的長短[31]。混合接種和過程接種會在一定程度上影響酒精發酵，對于葡萄酒香氣物質的形成存在不可控性。因此，目前在葡萄酒釀造中都是采用順序接種。

3.3 微生物間相互作用

酵母菌和酒酒球菌有一定的抑制作用。首先，酒酒球菌能產生分解酵母菌細胞壁的β-1，3葡聚糖酶[32]；其次，酵母菌會產生抑制肽、酒精和中鏈脂肪酸，它們在一定的濃度下也會抑制酒酒球菌的生長[33]。葡萄酒在酒精發酵結束后，存在一些酵母沒有利用完的營養物質，同時酵母菌自溶會釋放蛋白質等大分子化合物[34]。此時，葡萄酒中存在的乳酸菌群體就會相互競爭這些營養物質，其中植物乳桿菌和戊糖片球菌會產生一些短肽和蛋白質，會對酒酒球菌有強烈的抑制作用，雖然會造成酒酒球菌生長速率降低，但是對其并沒有致死作用[35]。希氏乳桿菌也會和酒酒球菌競爭氮源和多肽，會產生一種互害共棲的關系[36]。在葡萄酒釀造時，可以通過人工添加酒酒球菌的方式，有利于蘋乳發酵的進行。

4 酒酒球菌分子生物學研究

分子生物學是從分子水平上闡明遺傳、生殖、生長和發育等生命特征的分子機理，從而為利用和改造生物奠定理論基礎和提供新手段。長期以來，人們利用這一技術對酒酒球菌也進行了深入研究，現階段對其的研究主要集中在以下幾個方面：種類鑒定、遺傳圖譜構建、全基因組測序、種群遺傳學、抗脅迫性分子機理及調控等[37-38]。

通過酒酒球菌完整基因組序列，可以預測其生理學特性，并且驗證相關基因在釀酒中的功能。其中蘋乳發酵啟動的相關基因mleA（蘋果酸乳酸酶基因）及mleP（蘋果酸轉運蛋白基因）研究比較多，一般都會將這兩個基因外源表達在酵母中，雖然這樣能夠使酵母同時具備啟動蘋乳發酵載體的功能，但蘋乳發酵還會涉及其他物質的代謝，是酵母無法替代的[39-40]。因此，如果利用分子生物學技術對酒酒球菌進行改造，有利于更高效的進行蘋乳發酵啟動，同時酒酒球菌本身也會賦予葡萄酒更加豐富的香氣成分。可是目前由于酒酒球菌具有生長緩慢，不易培養等特點，同時又缺乏相關的載體，因此對其進行轉化存在相當大的困難。

5 結語

酒酒球菌作為葡萄酒蘋乳發酵的啟動者和執行者，優良菌株的篩選及其釀酒特性一直是人們的研究重點。優良酒酒球菌能夠代謝蘋果酸、糖、含氮物質等，產生的次級代謝物能夠豐富葡萄酒風味，提高葡萄酒感官品評。酒酒球菌在復雜的葡萄酒環境中，每一個因素都能影響其生長繁殖和代謝，各個因素作用機制尚不明確，這些因素對酒酒球菌的作用機理還有待研究。酒酒球菌工程菌株構建一直還未明了，如果將有利于葡萄酒香氣的相關基因表達到酒酒球菌中，能夠在葡萄酒發酵的最后階段對其香氣的形成有很好的塑造作用。因此，未來對酒酒球菌的作用機理研究和工程菌株的構建將是其研究重點。