近紅外光譜技術(shù)用于清開(kāi)靈顆粒七混浸膏中3 種成分含量的快速測(cè)定

黃江劍，吳斌，肖利穎，林嘉凱，劉順國(guó)，陳紅英

廣州白云山明興制藥有限公司，廣州 510250

清開(kāi)靈顆粒是由多種藥材提取濃縮后加入適量輔料制成的顆粒，課題組前期對(duì)清開(kāi)靈顆粒成品的含量進(jìn)行研究［1］，本文從生產(chǎn)過(guò)程出發(fā)，研究清開(kāi)靈顆粒生產(chǎn)過(guò)程（清開(kāi)靈七混浸膏）含量的快速測(cè)定方法。

清開(kāi)靈顆粒七混浸膏是清開(kāi)靈顆粒生產(chǎn)過(guò)程的中間體，是由板藍(lán)根、梔子、金銀花、膽酸等組方通過(guò)不同處理方式濃縮成相對(duì)密度的浸膏，含有梔子苷、膽酸及總氮，生產(chǎn)過(guò)程中常采用高效液相法及凱氏定氮法［2］測(cè)定含量。高效液相法雖然檢驗(yàn)準(zhǔn)確，但檢測(cè)過(guò)程中使用大量污染環(huán)境的化學(xué)試劑如乙腈、甲醇；凱氏定氮法檢測(cè)樣品需要時(shí)間長(zhǎng)，兩者都具有明顯的滯后性；而近紅外（near-infrared，NIR）分析技術(shù)具有分析速度快、效率高、不損傷樣品、成本低、無(wú)污染和便于實(shí)現(xiàn)在線分析等特點(diǎn)［3］，近年來(lái)被許多學(xué)者應(yīng)用于含量的快速檢測(cè)研究［4-8］，為此，本文采用近紅外光譜技術(shù)建立含量模型，采用不同處理方法優(yōu)選最佳含量模型，為清開(kāi)靈顆粒實(shí)現(xiàn)連續(xù)生產(chǎn)提供技術(shù)支持。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

waters e2695 高效液相色譜儀（紫外檢測(cè)器及蒸發(fā)光散射，美國(guó)Waters 公司）；KQ5200E 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Antaris Ⅱ傅里葉變換近紅外光譜（ThermoFisherScientific 公司）；Sartorius BS110S 電子天平（德國(guó)賽多利斯公司）；V3.0THUNIR 化學(xué)計(jì)量學(xué)軟件（清華大學(xué)）。

1.2 試藥

膽酸對(duì)照品（批號(hào)：100078-201814）、梔子苷對(duì)照品（批號(hào)：110749-201901）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；色譜甲醇、色譜乙腈、色譜冰醋酸（美國(guó)Merck 公司）；超純水（自制）。清開(kāi)靈顆粒七混浸膏（自編批號(hào):01-79）由廣州白云山明興制藥有限公司提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 清開(kāi)靈顆粒七混浸膏梔子苷、膽酸和總氮的含量測(cè)定

按照中國(guó)藥典［2］收錄的HPLC 及凱氏定氮儀檢測(cè)方法進(jìn)行含量測(cè)定，測(cè)定的含量作為測(cè)定真實(shí)含量。所測(cè)得的含量分布如圖1。

圖1 3成分含量分布圖

2.2 近紅外光譜數(shù)據(jù)采集

2.2.1 測(cè)試條件采用空氣為參比，采用光譜透射法采集樣品光譜圖，每個(gè)樣品平行測(cè)定3 次。設(shè)定測(cè)定參數(shù)為分辨率8 cm-1，背景掃描32 次，掃描光譜范圍：10 000～4 000 cm-1，溫度為20～25 ℃，相對(duì)濕度為50～65%。

2.2.2 樣品的制備由于清開(kāi)靈顆粒七混浸膏是濃縮的浸膏，密度較大，課題組對(duì)樣品進(jìn)行稀釋：精密稱定樣品約2 g，置100 mL 量瓶中，加入水70 mL，超聲處理（功率180 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，加水至刻度，搖勻，濾過(guò)，為樣品液。

2.2.3 數(shù)據(jù)采集與處理取樣品液加入2 mm 石英比色皿，按照“2.2.1”項(xiàng)下的方法對(duì)79 批樣品進(jìn)行近紅外光譜采集。從采集光譜的79 批樣品中，選取64 個(gè)樣品組成校正集，剩余15 個(gè)樣品為驗(yàn)證集。校正集與驗(yàn)證集的含量分布見(jiàn)表1。

表1 校正集與驗(yàn)證集樣品含量分布表 mg/袋

在光譜的采集過(guò)程中，環(huán)境、儀器及測(cè)定條件等的細(xì)微差異可能導(dǎo)致光譜的變化，可以通過(guò)預(yù)處理消除此類影響，常見(jiàn)的預(yù)處理方法有卷積平滑、一階卷積求導(dǎo)、二階卷積求導(dǎo)、多元散色校正、標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量變換和歸一化法等［9］。本文應(yīng)用THUNIR V3.0 軟件對(duì)采集到的近紅外光譜圖進(jìn)行預(yù)處理，并采用不同波段選擇方法如相關(guān)系數(shù)法、迭代優(yōu)化等方法對(duì)光譜進(jìn)行優(yōu)化，選擇偏最小二乘回歸法對(duì)樣品的光譜數(shù)據(jù)與含量數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合計(jì)算，建立校正模型。

使用不同的預(yù)處理方法對(duì)圖譜進(jìn)行處理，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 清開(kāi)靈顆粒七混浸膏不同預(yù)處理方法的近紅外圖譜

2.3 建立定量模型

應(yīng)用清華大學(xué)分析軟件THUNIR V3.0，采用決定系數(shù)（R2）、交叉檢驗(yàn)的校正標(biāo)準(zhǔn)偏差（SECV）、校正標(biāo)準(zhǔn)偏差（SEC）和主因子數(shù)（LV）來(lái)評(píng)價(jià)模型的預(yù)測(cè)性能。其中，R2 越接近1，SEC 越小，則校正值與近紅外預(yù)測(cè)值相關(guān)性越好［1］。

不同波段選擇方法獲得的梔子苷模型優(yōu)化結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同方法所建立的梔子苷的校正模型參數(shù)

從上述表得出，迭代優(yōu)化波長(zhǎng)選擇2 的模型參數(shù)最好，決定系數(shù)最高，因此，選擇其為最佳模型，最佳模型SEC 隨主成分?jǐn)?shù)變化圖見(jiàn)圖3，預(yù)測(cè)值與參考值的相關(guān)圖見(jiàn)圖4，預(yù)測(cè)值與參考值偏差圖見(jiàn)圖5。

圖3 梔子苷最佳模型SEC隨主成分?jǐn)?shù)變化圖

圖4 梔子苷NIR預(yù)測(cè)值與參考值相關(guān)圖

圖5 梔子苷 NIR預(yù)測(cè)值與參考值偏差

由圖4、5 可知，梔子苷最佳模型的參數(shù)為：波段選擇方法為迭代優(yōu)化波長(zhǎng)選擇方法2、LV為15、譜圖預(yù)處理為一階卷積求導(dǎo)、波段范圍7 586.588～8 778.380、R2 為0.999 9、SECV 為0.657 1、SEC 為0.002 0。

同樣，按梔子苷建模方法優(yōu)化膽酸和總氮的模型，優(yōu)化后的最佳光譜模型見(jiàn)表3。

表3 3成分最佳模型校正參數(shù)

2.4 校正模型的驗(yàn)證

將采集的15 批驗(yàn)證集原始光譜數(shù)據(jù)輸入上述建立的最優(yōu)校正模型中，預(yù)測(cè)3 種成分的含量即預(yù)測(cè)值，并與用HPLC、凱氏定氮法測(cè)定的真實(shí)含量進(jìn)行比較；結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖6 可知，NIR 所建模型預(yù)測(cè)梔子苷、膽酸、總氮的含量結(jié)果與HPLC、凱氏定氮法的測(cè)定結(jié)果接近，絕對(duì)平均偏差分別為0.5 %、1.3 %、0.6 %，表明建立的定量模型的預(yù)測(cè)性能均較好。

圖6 3種成分預(yù)測(cè)值和真實(shí)值對(duì)比圖

3 討論

本文選取64 批清開(kāi)靈顆粒七混浸膏為樣品集，用不同的預(yù)處理方法和波長(zhǎng)選擇方法建立近紅外光譜的校正模型，通過(guò)不同的參數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)模型的預(yù)測(cè)性能，并對(duì)15 批驗(yàn)證集的樣品進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。通過(guò)分析比較，預(yù)測(cè)結(jié)果與HPLC 和凱氏定氮儀法的測(cè)定結(jié)果接近，表明預(yù)測(cè)模型可以快速準(zhǔn)確地檢測(cè)出樣品中梔子苷、膽酸、總氮含量，故本文建立的定量模型可作為清開(kāi)靈顆粒七混浸膏含量測(cè)定的依據(jù)，可為清開(kāi)靈顆粒實(shí)現(xiàn)在線檢測(cè)、連續(xù)生產(chǎn)提供有力的技術(shù)支持。

然而，本研究只對(duì)濃縮后的清開(kāi)靈顆粒七混浸膏進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，清開(kāi)靈顆粒七混浸膏是清開(kāi)靈顆粒生產(chǎn)過(guò)程的中間體，要實(shí)現(xiàn)連續(xù)生產(chǎn)、在線檢測(cè)需對(duì)濃縮過(guò)程不同密度的樣品進(jìn)行取樣檢測(cè)，建立相對(duì)較全面的樣品集，使得建立的模型更準(zhǔn)確。