近紅外光譜技術用于清開靈顆粒七混浸膏中3 種成分含量的快速測定

黃江劍，吳斌，肖利穎，林嘉凱，劉順國，陳紅英

廣州白云山明興制藥有限公司，廣州 510250

清開靈顆粒是由多種藥材提取濃縮后加入適量輔料制成的顆粒，課題組前期對清開靈顆粒成品的含量進行研究［1］，本文從生產過程出發，研究清開靈顆粒生產過程（清開靈七混浸膏）含量的快速測定方法。

清開靈顆粒七混浸膏是清開靈顆粒生產過程的中間體，是由板藍根、梔子、金銀花、膽酸等組方通過不同處理方式濃縮成相對密度的浸膏，含有梔子苷、膽酸及總氮，生產過程中常采用高效液相法及凱氏定氮法［2］測定含量。高效液相法雖然檢驗準確，但檢測過程中使用大量污染環境的化學試劑如乙腈、甲醇；凱氏定氮法檢測樣品需要時間長，兩者都具有明顯的滯后性；而近紅外（near-infrared，NIR）分析技術具有分析速度快、效率高、不損傷樣品、成本低、無污染和便于實現在線分析等特點［3］，近年來被許多學者應用于含量的快速檢測研究［4-8］，為此，本文采用近紅外光譜技術建立含量模型，采用不同處理方法優選最佳含量模型，為清開靈顆粒實現連續生產提供技術支持。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

waters e2695 高效液相色譜儀（紫外檢測器及蒸發光散射，美國Waters 公司）；KQ5200E 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Antaris Ⅱ傅里葉變換近紅外光譜（ThermoFisherScientific 公司）；Sartorius BS110S 電子天平（德國賽多利斯公司）；V3.0THUNIR 化學計量學軟件（清華大學）。

1.2 試藥

膽酸對照品（批號：100078-201814）、梔子苷對照品（批號：110749-201901）均購自中國食品藥品檢定研究院；色譜甲醇、色譜乙腈、色譜冰醋酸（美國Merck 公司）；超純水（自制）。清開靈顆粒七混浸膏（自編批號:01-79）由廣州白云山明興制藥有限公司提供。

2 方法與結果

2.1 清開靈顆粒七混浸膏梔子苷、膽酸和總氮的含量測定

按照中國藥典［2］收錄的HPLC 及凱氏定氮儀檢測方法進行含量測定，測定的含量作為測定真實含量。所測得的含量分布如圖1。

圖1 3成分含量分布圖

2.2 近紅外光譜數據采集

2.2.1 測試條件采用空氣為參比，采用光譜透射法采集樣品光譜圖，每個樣品平行測定3 次。設定測定參數為分辨率8 cm-1，背景掃描32 次，掃描光譜范圍：10 000～4 000 cm-1，溫度為20～25 ℃，相對濕度為50～65%。

2.2.2 樣品的制備由于清開靈顆粒七混浸膏是濃縮的浸膏，密度較大，課題組對樣品進行稀釋：精密稱定樣品約2 g，置100 mL 量瓶中，加入水70 mL，超聲處理（功率180 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，加水至刻度，搖勻，濾過，為樣品液。

2.2.3 數據采集與處理取樣品液加入2 mm 石英比色皿，按照“2.2.1”項下的方法對79 批樣品進行近紅外光譜采集。從采集光譜的79 批樣品中，選取64 個樣品組成校正集，剩余15 個樣品為驗證集。校正集與驗證集的含量分布見表1。

表1 校正集與驗證集樣品含量分布表 mg/袋

在光譜的采集過程中，環境、儀器及測定條件等的細微差異可能導致光譜的變化，可以通過預處理消除此類影響，常見的預處理方法有卷積平滑、一階卷積求導、二階卷積求導、多元散色校正、標準正態變量變換和歸一化法等［9］。本文應用THUNIR V3.0 軟件對采集到的近紅外光譜圖進行預處理，并采用不同波段選擇方法如相關系數法、迭代優化等方法對光譜進行優化，選擇偏最小二乘回歸法對樣品的光譜數據與含量數據進行回歸擬合計算，建立校正模型。

使用不同的預處理方法對圖譜進行處理，結果見圖2。

圖2 清開靈顆粒七混浸膏不同預處理方法的近紅外圖譜

2.3 建立定量模型

應用清華大學分析軟件THUNIR V3.0，采用決定系數（R2）、交叉檢驗的校正標準偏差（SECV）、校正標準偏差（SEC）和主因子數（LV）來評價模型的預測性能。其中，R2 越接近1，SEC 越小，則校正值與近紅外預測值相關性越好［1］。

不同波段選擇方法獲得的梔子苷模型優化結果見表2。

表2 不同方法所建立的梔子苷的校正模型參數

從上述表得出，迭代優化波長選擇2 的模型參數最好，決定系數最高，因此，選擇其為最佳模型，最佳模型SEC 隨主成分數變化圖見圖3，預測值與參考值的相關圖見圖4，預測值與參考值偏差圖見圖5。

圖3 梔子苷最佳模型SEC隨主成分數變化圖

圖4 梔子苷NIR預測值與參考值相關圖

圖5 梔子苷 NIR預測值與參考值偏差

由圖4、5 可知，梔子苷最佳模型的參數為：波段選擇方法為迭代優化波長選擇方法2、LV為15、譜圖預處理為一階卷積求導、波段范圍7 586.588～8 778.380、R2 為0.999 9、SECV 為0.657 1、SEC 為0.002 0。

同樣，按梔子苷建模方法優化膽酸和總氮的模型，優化后的最佳光譜模型見表3。

表3 3成分最佳模型校正參數

2.4 校正模型的驗證

將采集的15 批驗證集原始光譜數據輸入上述建立的最優校正模型中，預測3 種成分的含量即預測值，并與用HPLC、凱氏定氮法測定的真實含量進行比較；結果見圖6。由圖6 可知，NIR 所建模型預測梔子苷、膽酸、總氮的含量結果與HPLC、凱氏定氮法的測定結果接近，絕對平均偏差分別為0.5 %、1.3 %、0.6 %，表明建立的定量模型的預測性能均較好。

圖6 3種成分預測值和真實值對比圖

3 討論

本文選取64 批清開靈顆粒七混浸膏為樣品集，用不同的預處理方法和波長選擇方法建立近紅外光譜的校正模型，通過不同的參數來評價模型的預測性能，并對15 批驗證集的樣品進行預測分析。通過分析比較，預測結果與HPLC 和凱氏定氮儀法的測定結果接近，表明預測模型可以快速準確地檢測出樣品中梔子苷、膽酸、總氮含量，故本文建立的定量模型可作為清開靈顆粒七混浸膏含量測定的依據，可為清開靈顆粒實現在線檢測、連續生產提供有力的技術支持。

然而，本研究只對濃縮后的清開靈顆粒七混浸膏進行數據采集，清開靈顆粒七混浸膏是清開靈顆粒生產過程的中間體，要實現連續生產、在線檢測需對濃縮過程不同密度的樣品進行取樣檢測，建立相對較全面的樣品集，使得建立的模型更準確。