柏子養心丸多波長切換HPLC指紋圖譜的建立及特征峰的歸屬分析

任琦，游媛，洪挺，趙雯，許妍，萬林春

江西省藥品檢驗檢測研究院，國家藥品監督管理局中成藥質量評價重點實驗室，江西省藥品與醫療器械質量工程技術研究中心，南昌 330029

柏子養心丸為國家基本藥物，處方由炙黃芪、黨參、川芎、當歸、柏子仁、酸棗仁、制遠志、醋五味子、肉桂、茯苓、半夏曲、朱砂、炙甘草十三味藥組成。具補氣、養血、安神之功效。用于心氣虛寒、心悸易驚、失眠多夢，健忘等癥［1］。

柏子養心丸療效確切，臨床應用廣泛［2-5］。方中炙黃芪、黨參合為君藥；當歸、川芎、柏子仁為臣藥；酸棗仁、遠志、五味子、肉桂、茯苓、半夏、朱砂共為佐藥；甘草為使藥［6］。全方通過不同活性成分群之間發揮協同作用，共奏補氣、養血、安神之效。因此，方中藥材的穩定性對于制劑的質量起著至關重要的作用，同時也極大地影響著臨床使用的安全性及有效性［7］。近年來，指紋圖譜技術能夠全面、準確、整體的反映制劑整體質量，現已廣泛地運用于制劑的質量控制與評價［8］。目前，關于柏子養心丸指紋圖譜的研究主要集中在毛細管指紋圖譜［9］、數字化指紋圖譜［10］及比率指紋圖譜［11］等，但由于柏子養心丸中藥味多、成分種類各異，其紫外吸收波長不一，在同一波長下不能同時呈現在同一液相指紋圖譜中。故本文建立多波長切換HPLC指紋圖譜［12-15］更能準確、直觀反映多組分下色譜峰的信息，為科學評價及有效控制柏子養心丸的質量提供可靠方法。

1 儀器與試藥

Agilent 1260 系列高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；Sartorius BSA 124S-CW 電子天平（德國Sartorius 公司）；Sartorius BT 25S電子天平（德國Sartorius 公司）；KQ-500DE 超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）。阿魏酸對照品（批號：110773-201313）、桂皮醛對照品（批號：110710-201217）、五味子醇甲對照品（批號：110857-201412）、五味子酯甲對照品（批號：111529-200503）、五味子甲素對照品（批號：110764-200107）、五味子乙素對照品（批號：110765-200508）、川芎對照藥材（批號：120918-201411）、當歸對照藥材（批號：120927-201516）、肉桂對照藥材（批號：121363-201102）、五味子對照藥材（批號：120922-201309）均購自中國食品藥品檢定研究院；洋川芎內酯A 對照品（批號：141204）、Z-藁本內酯對照品（批號：150604）均購自上海胤珂生物科技有限公司。甲醇為色譜純；乙腈為色譜純；水為Milli-Q 制備的純化水；其他試劑為分析純。30批柏子養心丸來源于5 個企業（北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠，批號：15035315、15035306、15035305、15035173、15035171、15035168，批準文號：國藥準字Z11020080，規格：每100 粒重10 g；江西藥都樟樹制藥有限公司，批號：150403、150401、150503、150402、150406、150411，批準文號：國藥準字Z36021835，規格：每瓶裝60 g；九芝堂股份有限公司，批號：201507042、201507041、201504014、201504001、201507042、201504004，批準文號：國藥準字Z43020150，規格：每瓶裝120 g；南京同仁堂藥業有限責任公司，批號：140909、140203、150402、150307、150305、150403，批準文號：國藥準字Z32020029，規格：每瓶裝60 g；蕪湖張恒春藥業有限公司，批號：1503071、1503101、1505221、1504151、1504211、1501101，批準文號：國藥準字Z34020946，規格：每瓶裝36 g）。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液的制備 取阿魏酸、桂皮醛、洋川芎內酯A、五味子醇甲、Z-藁本內酯、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素對照品適量，精密稱定，分別加甲醇制成每1 mL 含20 μg 的溶液，搖勻，即得。

2.1.2 供試品溶液的制備 取本品水蜜丸研碎；小蜜丸剪碎，混勻，取本品約6 g，精密稱定，精密加50%乙醇25 mL，置具塞錐形瓶中，稱定重量，超聲處理（功率：500 W，頻率：40 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用50%乙醇補足減失的重量，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，取續濾液，即得。

2.2 色譜條件

采用Waters Sunfire C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；以甲醇為流動相A，以0.1%冰醋酸溶液為流動相B，梯度洗脫（0～70.0 min，20%→80% A；70.0～85.0 min，80.0% A；85.01～95.0 min，20% A）；流速為1.0 mL/min；波長切換（0～31 min，335 nm；31～52.5 min，285 nm；52.5～85 min，215 nm）；柱溫為35 ℃；進樣量：20 μL。

2.3 指紋峰指認

取“2.1”項下參照物溶液進樣檢測，記錄色譜圖。色譜圖見圖1。

2.4 空白溶劑試驗

取50%乙醇，采用“2.2”項下色譜條件，進樣，記錄色譜圖。結果顯示空白溶劑在色譜圖中未出現與供試品溶液相應的色譜峰。色譜圖見圖2。

2.5 精密度試驗

取柏子養心丸（北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠，批號：15035315）1 份，按“2.1.2”項下方法制備，連續進樣6 次，測定，記錄各色譜峰保留時間和峰面積。以4 號色譜峰的保留時間及積分峰面積為參照，計算樣品中主要色譜峰的相對保留時間和相對峰面積，并求出對應的RSD%和平均值，并計算精密度試驗相似度。結果各色譜峰的相對保留時間的比值較穩定（RSD ＜1%）；相對峰面積比值較穩定（RSD ＜5%），圖譜相互間相似度均大于0.90，表明本測定方法精密度良好。

2.6 穩定性試驗

取柏子養心丸（北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠，批號：15035315）6 份，按“2.1.2”項下方法制備，進樣，分別于0、2、4、12、24 h測定指紋圖譜，記錄各色譜峰保留時間和峰面積。以4 號色譜峰的保留時間和峰面積為參照，計算樣品中主要色譜峰的相對保留時間和相對峰面積，并計算穩定性試驗相似度。結果各色譜峰的相對峰面積比值較穩定（RSD ＜5%）；相對保留時間的比值較穩定（RSD ＜1%），圖譜相互間相似度均大于0.90，表明本測定方法至少在24 h 內穩定性良好。

2.7 重復性試驗

取柏子養心丸（北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠，批號：15035315）6 份，照“2.1.2”項下方法制備，進樣，測定，記錄各色譜峰保留時間和峰面積。以4 號色譜峰的保留時間和峰面積為參照，計算樣品中主要色譜峰的相對保留時間和相對峰面積，并計算重現性試驗相似度。結果表明：各色譜峰的相對保留時間的比值較穩定（RSD ＜1%）；相對峰面積比值較穩定（RSD ＜5%），圖譜相互間相似度均大于0.90，表明本測定方法重現性良好。

2.8 對照指紋圖譜的建立

從5 個生產廠家中選取3 批樣品，按“2.1.2”項下方法制備，進樣，測定，記錄色譜圖。將15批樣品色譜圖導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2012 年版，選取“時間窗寬度”為0.10 min，對照圖譜的生成方法為“中位數”，自動匹配后，得到柏子養心丸多波長切換HPLC 對照指紋圖譜。色譜圖見圖3。

2.9 柏子養心丸與原藥材之間的相關性分析

取川芎、當歸、肉桂、五味子對照藥材適量，分別按“2.1.2”項下方法制備，進樣，測定，記錄色譜圖。通過色譜峰對比，確定了8 個色譜峰為特征峰，其中峰1、5 為屬川芎及當歸藥材特征峰；峰3 為屬川芎特征峰；峰2 為屬肉桂特征峰、峰4、6、7、8為五味子特征峰。色譜圖見圖4。

2.10 成品指紋圖譜的測定

按“2.1.2”項下方法制備30 批柏子養心丸供試品溶液并測定，所得指紋圖譜分別與對照指紋圖譜用相似度軟件進行計算，結果30 批次樣品的指紋圖譜相似度均＞0.9，相似度良好。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

由于柏子養心丸成分的復雜性和多樣性，不同的化學成分紫外吸收波長不同。阿魏酸的最大吸收波長為（323±2）nm，桂皮醛的最大吸收波長為（291±2）nm，洋川芎內酯A 的最大吸收波長為（282±2）nm，五味子醇甲的最大吸收波長為（215±2）nm、Z-藁本內酯的最大吸收波長為（206±2）nm、五味子酯甲的最大吸收波長為（221±2）nm、五味子甲素的最大吸收波長為（215±2）nm、五味子乙素的最大吸收波長為（215±2）nm，為使各峰的響應值均較大，最終確定按照“2.2”項下檢測波長切換條件。

3.2 流速相系統及比例的選擇

本實驗考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%甲酸溶液、甲醇-0.2%甲酸溶液、甲醇-0.5%甲酸溶液、甲醇-0.1%冰醋酸溶液、甲醇-0.1%磷酸溶液7 個不同流動相系統。結果甲醇-水流動相系統優于乙腈-水系統，其中以甲醇-0.1%甲酸溶液流動相系統分離度好且基線平穩。并對流動相比例進行優化，最終確定按照“2.2”項下梯度洗脫的流動相比例。

3.3 供試品溶液制備的選擇

本實驗考察了不同提取方式（超聲處理15、30、60、90 min，加熱回流60 min），結果兩種提取方式供試品均能達到良好的分離，考慮操作方便并節省時間，故確定本品提取方法為超聲處理30 min。同時考察了不同提取溶劑種類（50%甲醇、50%乙醇、甲醇、乙醇），結果四種溶劑提取供試品均能達到良好的分離，其中50%乙醇各組分響應較大且更加環保，故確定50%乙醇為提取溶劑。

3.4 小結

本實驗建立柏子養心丸多波長切換HPLC 指紋圖譜，共有8 個共有峰，所對應共有峰的相對保留時間穩定，方法學考察表明精密度、穩定性、重復性均符合要求。利用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2012 年版，計算出相似度符合國家相關要求，為科學評價及有效控制柏子養心丸的質量提供可靠方法。