凝膠排阻層析純化破傷風抗毒素條件優化的研究

周年，王安華，洪燕，鄭洋濱，劉寧

1.江西省藥品檢驗檢測研究院，國家藥品監督管理局中成藥質量評價重點實驗室，江西省藥品與醫療器械質量工程技術研究中心，南昌 330029；2.南昌軌道交通集團有限公司，南昌 330038

破傷風抗毒素是經典的一種馬抗血清制品，它能中和血液中破傷風梭菌產生的破傷風毒素，緩解破傷風癥狀和降低病死率。人類應用破傷風抗毒素防治破傷風歷史已近百年，挽救了許多人的生命，但其臨床應用存在一定的局限性［1］。傳統工藝生產的破傷風抗毒素有效成分F（ab'）2純度較低，殘存的大分子馬免疫球蛋白（IgG）及小分子雜蛋白引起的不良反應發生率高，制約了破傷風抗毒素的臨床應用和進一步發展。因此本研究根據破傷風抗毒素成品中F（ab'）2、IgG 及小分子雜蛋白分子量的不同，擬應用凝膠排阻層析，以紫外檢測蛋白質特征峰A280nm 繪制的散點圖為評價指標，考察不同流速、洗脫劑、樣品濃度對破傷風抗毒素蛋白分離的影響，經非還原型十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠電泳后對不同組分染色結果進行掃描對比；按照《中國藥典》2015 版異常毒性檢查法對純化后的組分進行安全性檢查。

1 材料與方法

1.1 材料

破傷風抗毒素（0.75 mL，1 500 IU/支），購自江西生物制品研究所，批號：20 180106；葡聚糖凝膠G-100（Sephadex G-100）（批號：10244707，瑞典GE healthcare Bio-Science）；磷酸二氫鉀（批號：20180703，國藥集團化學試劑有限公司）；氫氧化鈉（批號：20160518，廣東光華科技股份有限公司）；蛋白分子量標準品（10-180 KDa）：（伊萊薩，批號：EL2661）；常規考馬斯亮藍染色液，批號：1210A19，Tris-HCl 緩沖液（0.5 mol/L，pH6.8），丙烯酰胺-亞甲基雙丙烯酰胺溶液（30%，29∶1），批號：1210A19，均購自北京雷根生物技術有限公司；其他化學試劑均為分析純或化學純。

1.2 實驗動物

健康豚鼠4 只，雄性，體重250～350 g，動物合格證號：No.1107262011 001398；健康KM 小鼠10 只，雌雄各半，體重18～22 g，動物合格證號：No.430726201100264323，均購自長沙市天勤生物技術有限公司，實驗動物生產許可證號：SCXK（湘）：2019-0014。小鼠、豚鼠分別飼養于本院屏障環境和普通環境中，實驗動物使用許可證號：SYXK（贛）：2019-0001。

1.3 儀器與設備

SBS-100 數控計滴自動部分收集器（上海滬西分析儀器廠有限公司）；FreeZone?2.5 升冷凍干燥機（美國labconco 公司）；UV-2600 紫外分光光度計（日本島津）；Bio-Rad 電泳儀（美國伯樂公司）；Milli-Q Reference 超純水儀（密理博）；UW2200H動物天平（日本島津）。

1.4 Sephadex G-100 正式裝柱處理流程

1.4.1 預處理 用超純水煮沸至少1 h 直至充分溶脹，凝膠體積不再變化，期間不斷攪拌以保證凝膠溶脹。在溶脹前，自然沉降后若上層溶液中漂浮的凝膠碎片顆粒較多，需要重復多次漂洗將其除去，防止層析時阻塞凝膠柱影響流速。

1.4.2 裝柱 將溶脹好的凝膠根據裝柱要求一次性置入玻璃柱內，注意保持濕態裝柱，并避免柱內產生氣泡或斷層，裝柱要均勻。

1.5 破傷風抗毒素凝膠排阻層析分離、純化條件的研究

經過預處理的Sephadex G-100 進行裝柱，凝膠柱規格：150 cm×2.5 cm，先用洗脫液平衡直到流出液的pH 值等于上柱洗脫液的pH 值后，上樣、洗脫。檢測波長：280 nm，采用數控計滴自動部分收集器每間隔一段時間收集一管洗脫組分。每個組分管重復收集5 次，合并相同次數的組分，冷凍干燥，進行異常毒性檢查。

1.5.1 不同洗脫液流速 根據凝膠柱規格，按照分級分離原則將上樣體積約定為柱床體積的1%即為5 mL。以磷酸鹽緩沖液（pH6.5）作為洗脫液，樣品濃度為原液（100%），分別控制流速為0.6 mL/min、0.3 mL/min，研究不同流速對破傷風抗毒素蛋白分離效果影響。

1.5.2 不同洗脫液 固定上樣體積為5 mL，樣品濃度為100%，洗脫液流速0.3 mL/min，分別以超純水、磷酸鹽緩沖液（pH6.5）作為洗脫液，研究不同洗脫液對破傷風抗毒素蛋白分離效果影響。

1.5.3 不同樣品濃度 以磷酸鹽緩沖液（pH6.5）作為洗脫液，固定上樣體積為5 mL，流速為0.3 mL/min，樣品濃度分別為80%、100%，研究上樣濃度對破傷風抗毒素蛋白分離效果影響。

1.6 經Sephadex G-100 純化前后F（ab'）2 電泳染色圖對比

根據紫外檢測蛋白質特征峰A280nm繪制的散點圖，取經Sephadex G-100 純化后處于散點圖峰值附近的四管組分管（分別標記為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ），加4×上樣緩沖液混勻后100 ℃水浴5 min，經非還原型SDS-PAGE 凝膠電泳（上樣量：8 μL；以恒壓60 V 條件開始電泳至跑至分離膠調至100 V）后，參照考馬斯亮藍染色液說明書將電泳后的凝膠染色，脫水至條帶清晰后拍照保存，并將圖像背景調至白色，蛋白條帶為灰色。

1.7 經Sephadex G-100 純化后Ⅲ組分異常毒性的檢查

選取上述1.6 的Ⅲ組分管，重復收集5 次，合并相同的組分，冷凍干燥，按照《中國藥典》2015版異常毒性檢查法進行異常毒性檢查。

2 結果

2.1 不同洗脫液流速對Sephadex G-100 分離蛋白效果的影響

由圖1 可以發現，A 流速（0.3 mL/min）的分離效果優于B 流速（0.6 mL/min），因此，本實驗選擇洗脫流速為0.3 mL/min。

2.2 不同洗脫液對Sephadex G-100 分離蛋白效果的影響

由圖2 可知，不同的洗脫液對Sephadex G-100分離蛋白效果基本無影響，對上樣的樣品進行pH檢測結果為6.5。為更好地考慮整個分離過程中樣品的穩定性，我們選擇跟樣品相同pH 的磷酸鹽緩沖液作為洗脫液。

2.3 不同樣品濃度對Sephadex G-100 分離蛋白效果的影響

從圖3 可看出，當上樣濃度為100% 時，分離效果更好，同時凝膠排阻層析分離會使樣品稀釋，因此，在不影響分離效果的前提下，應盡可能提高上樣濃度。即本實驗選擇樣品濃度為100%。

2.4 破傷風抗毒素有效成分F（ab'）2 經Sephadex G-100 純化前后電泳染色圖對比

綜合2.1～2.3 的實驗結果，凝膠排阻層析分離破傷風抗毒素蛋白的優化條件為以磷酸鹽緩沖液（pH6.5）為洗脫液，樣品濃度為100%，流速為0.3 mL/min。選取處于散點圖兩個峰值附近的四管組分管（Ⅰ、Ⅱ為第一個峰值附近的兩管，Ⅲ、Ⅳ為第二個峰值附近的兩管）。從圖4 可知，整個純化過程中，I 組分為少量大分子IgG 與有效成分F（ab'）2先洗脫下來，Ⅱ組分為IgG、F（ab'）2與少量的小分子雜蛋白共同洗脫下來，Ⅲ組分主要為F（ab'）2洗脫下來，最后Ⅳ組分為F（ab'）2、小分子雜蛋白共同洗脫下來。其中Ⅲ組分F（ab'）2的純度最高。

2.5 經Sephadex G-100 純化后Ⅲ組分異常毒性的檢查

取純化后重復五次收集的Ⅲ組分，經冷凍干燥后，加入無菌生理鹽水溶解，分別采用小鼠及豚鼠腹腔注射溶液的方式（小鼠注射劑量為0.5 mL；豚鼠注射劑量為5 mL），觀察注射后反應情況和7 d內的死亡情況。結果小鼠及豚鼠觀察期內均健存，且無眼球突出、呼吸急促、行動失調、昏倒、麻痹、匍匐、痙攣、驚厥等反應，7 d 后小鼠及豚鼠的體重均增加，表示Ⅲ組分無異常毒性。

3 討論

當前破傷風抗毒素的生產工藝主要為破傷風類毒素免疫馬匹后采集的血漿經胃蛋白酶消化，后者在IgG 鉸鏈區二硫鍵的近羧基端處將其剪切為F（ab'）2片段和若干無生物活性的小分子多肽pFc'片段，然后去除大量白蛋白、可溶性雜質及Fc 片段，最后超濾除鹽、濃縮和去小分子蛋白。主要表現為有效成分F（ab'）2、大分子IgG 和小分子雜蛋白同時存在。大分子IgG 容易導致過敏性休克和血清病兩類過敏反應；小分子雜蛋白則是引起皮膚過敏試驗假陽性反應的主要物質，所以破傷風抗毒素在臨床使用前必須進行皮膚過敏試驗，簡稱皮試。據文獻資料報道，破傷風抗毒素的皮試陽性率達到52.5%，并且無論采用皮試陰性直接注射還是皮試陽性脫敏注射的方法，注射破傷風抗毒素均有較多的過敏反應產生［2-4］，因此在一些歐美發達國家早已禁止使用馬源破傷風抗毒素，而選擇20 世紀60 年代研制出的人破傷風免疫球蛋白代替，但由于存在市場血源供應嚴重不足、價格昂貴、產量極其不穩定、同源污染等缺點，因而在我國臨床上廣泛應用于破傷風被動免疫和破傷風治療的仍為破傷風抗毒素［5］。

《中國藥典》2015 版破傷風抗毒素檢驗項下F（ab'）2含量標準規定預防用及治療用從2010 版的應不低于50%及60%提升到了應不低于60%及70%，同時IgG 含量也從應不高于10%降低為應不高于5%［6,7］?？梢娽槍ζ苽L抗毒素生產工藝的發展現狀及其臨床使用的局限性，我國現行國家標準提高了對此類生物制品純化工藝的要求，建議增加柱色譜、免疫吸附等純化技術和完善酶解工藝［8,9］。本研究根據破傷風抗毒素成品中F（ab'）2、IgG 及小分子雜蛋白分子量的不同，使用Sephadex G-100裝柱，以紫外檢測蛋白質特征峰A280nm繪制的散點圖為評價指標，采用單因素試驗考察不同流速、洗脫液、樣品濃度對破傷風抗毒素蛋白分離的影響。確定了凝膠排阻層析純化破傷風抗毒素蛋白的最佳條件為以磷酸鹽緩沖液（pH6.5）為洗脫液，樣品濃度為100%，流速為0.3 mL/min；經非還原型SDS-PAGE 凝膠電泳結果表明在該條件下可以較好地純化破傷風抗毒素有效成分F（ab'）2，其中Ⅲ組分F（ab'）2的純度最高；異常毒性檢查小鼠及豚鼠均正常存活，表明Ⅲ組分無異常毒性。說明優化的凝膠排阻層析條件可以較好地純化破傷風抗毒素有效成分，且安全無毒，為進一步推動該類生物制品的質量提高提供參考。