美沙拉嗪對結腸炎大鼠腸黏膜完整性的影響

陳云，謝軍，黃才斌，葉菁,2*

1.贛南醫學院第一附屬醫院，江西 贛州 341001；2.江西中醫藥大學，南昌 330004

炎癥性腸病（Inflammatory Bowel Disease，IBD）是一種病因不明的慢性非特異性結腸炎癥疾病，包括潰瘍性結腸炎（Ulcerative Colitis，UC）與克羅恩病（Crohn's Disease，CD），其中UC 患者臨床常表現出反復性腹痛、腹瀉、黏液濃血便等癥狀，該病遷延不愈，嚴重影響患者生命質量［1,2］。臨床治療UC 的傳統藥物如柳氮磺胺吡啶水楊酸制劑、免疫抑制劑及糖皮質激素等雖具有明顯療效，但臨床副作用較多［3］。美沙拉嗪是治療IBD 的常用一線藥物，對于初發型輕中度病變的治療，療效明顯；隨著基礎研究的深入，發現其保護結腸上皮完整性與UC發生發展關系密切［4］。因此，本研究探討美沙拉嗪對UC 模型大鼠腸黏膜完整性的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級SD 大鼠40 只，雌雄各半，體重（200±20）g，由贛南醫學院實驗動物中心提供。大鼠飼養于贛南醫學院第一附屬醫院SPF 級動物實驗中心，溫度20～25 ℃，相對濕度50～70%，自由飲食飲水，12 h/12 h 晝夜節律適應性飼養1 周后進行造模實驗。

1.2 試劑及儀器

5%的2,4,6－三硝基苯磺酸（Trinitro-Benzene-Sulfonic Acid,TNBS；美國Sigma 公司）；美沙拉嗪緩釋顆粒劑（法國愛的發制藥公司，規格：0.5 g×10袋）；10%水合氯醛（上海安妍生物有限公司）；TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒（南京凱基生物科技發展有限公司）；石蠟切片機、攤片機、生物組織包埋機（德國萊卡公司）；生物熒光顯微鏡（日本Olympus 公司）。

1.3 研究方法

1.3.1 造模方法 采用TNBS/乙醇化學法誘導形成UC大鼠模型。對照組、結腸炎模型組、美沙拉嗪低劑量組、高劑量組，每組10 只，造模前均禁食1 d。用10%的水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉，隨后用聚丙烯管輕輕插入肛門，深度約8 cm，緩慢注入TNBS/乙醇混合溶劑（100 mg/kg），捏緊肛門5 min 左右，化學法誘導形成急性UC。造模7 d 后，隨機抽取2 只大鼠解剖觀察，病理結果顯示有小潰瘍面形成、充血水腫、炎性細胞浸潤，提示造模成功。造模后24 h分組灌胃治療，對照組、結腸炎模型組給予0.9%生理鹽水，而美沙拉嗪低劑量組、高劑量組分別給予美沙拉嗪（100、150 mg/kg）灌胃治療。

1.3.2 標本采集 每天記錄大鼠一般情況，并進行疾病活動指數（Disease Activity Index，DAI）評分。連續治療14 d 后，大鼠禁食24 h，稱重后麻醉，處死大鼠，顯微鏡觀察結腸病變情況及進行結腸粘膜損傷指數（Colon Mucosal Damage Index，CMDI）評分；隨后取結腸病變部位與4%多聚甲醛溶液中固定，再脫水透明處理，接著行石蠟包埋、組織切片、HE 染色、封片等處理，置于生物倒置顯微鏡觀察組織有無潰瘍面、結腸絨毛排列、充血及炎癥細胞浸潤等病理變化，檢測結腸上皮厚度，行組織學損傷指數（Tissue Damage Index，TDI）評分。

1.3.3 觀察指標 采用Olympus 顯微鏡觀察HE 染色切片上的結腸黏膜潰爛處，轉換高倍鏡觀察并取5個視野，用專業圖像分析軟件測量計算再生黏膜厚度與黏膜肌缺損寬度的平均值。

1.4 判定標準

DAI 評分包括體質量下降分數、便血分數及大便性狀分數，具體評分細則參考文獻［5］。CMDI評分標準細則見文獻［6］。TDI 評分標準見文獻［7］。TUNEL 法檢測細胞凋亡情況，凋亡細胞為棕色，正常細胞為藍紫色。細胞凋亡指數（AI）=（凋亡細胞數/細胞總數）×100%。

1.5 統計學方法

運用SPSS 22.0 進行數據分析。計量資料以均數±標準差（）描述，進行正態性與方差齊性分析；對正態分布數據，多組計量資料比較用One-Way ANOVA 分析，兩兩比較采用t檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況及組織病理學改變情況比較

結腸炎大鼠給予美沙拉嗪灌胃治療2 周后，大鼠體重增加，毛色有光澤，活動增加，糞便有顆粒狀或條狀，癥狀明顯改善。結腸炎模型組大鼠經TNBS 誘導后第6 d 出現腹瀉、體質量減輕及稀便；大鼠結腸組織出現腸管變粗和腸壁增厚，與腹腔內組織粘連，結腸黏膜明顯充血水腫，甚至形成糜爛和潰瘍，見圖1。顯微觀察可見模型組大鼠結腸組織見大量炎癥細胞浸潤，炎癥累及結腸腸壁全層，腸黏膜腺體被破壞且分布雜亂，較多部位有糜爛以及潰瘍形成，見圖2。第14 d 天后模型組大鼠表現為慢性炎癥，大量淋巴細胞浸潤，可見朗格漢斯巨細胞、肉芽腫形成、鋪路石樣改變。

2.2 各組大鼠DAI、CMDI、TDI 平均評分情況比較

使用TNBS/乙醇混合溶劑灌腸給藥后，模型組大鼠DAI、CMDI 和TDI 評分顯著高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；而美沙拉嗪低劑量組、高劑量組的上述評分明顯低于結腸炎模型組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 各組大鼠DAI、CMDI、TDI平均評分情況比較（，n=10） 分

表1 各組大鼠DAI、CMDI、TDI平均評分情況比較（，n=10） 分

注：與對照組相比，aP＜0.05；與結腸炎模型組相比，bP＜0.05；與美沙拉嗪低劑量相比，cP＜0.05。

2.3 各組大鼠再生黏膜厚度與黏膜肌缺損寬度比較

美沙拉嗪低劑量組與結腸炎模型組相比，結腸黏膜層缺損未出現明顯的再生修復，無明顯差異（P＞0.05）；美沙拉嗪高劑量組與結腸炎模型組相比，結腸黏膜層缺損有不同程度的修復與改善，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 各組大鼠再生黏膜厚度與黏膜肌缺損寬度比較（，n=10）

表2 各組大鼠再生黏膜厚度與黏膜肌缺損寬度比較（，n=10）

注：與結腸炎模型組相比，aP＜0.05；與美沙拉嗪低劑量組相比，bP＜0.05。

2.4 各組結腸上皮細胞凋亡情況比較

TUNEL 染色結果顯示，對照組結腸上皮細胞僅有少數凋亡，模型組結腸上皮細胞凋亡數量較多，而美沙拉嗪組結腸上皮細胞凋亡數量較模型組明顯減少，差異有統計學意義（P＜0.05）。

3 討論

UC 是一種難以治愈的慢性非特異性炎癥性疾病，病變部位集中于結直腸黏膜及黏膜下層，其臨床常表現為腹痛腹瀉、黏液膿血便［8］。該病病理機制尚不十分明確，研究認為其可能與感染因素、遺傳因素、免疫調節劑、個人心理因素等相關，導致患者腸道黏膜生物屏障損壞改變，引起免疫調節紊亂，最終造成機體炎癥性損傷，因此保護腸黏膜完整性對治療UC 具有重要作用［9］。美沙拉嗪為臨床治療UC 一線用藥，5-氨基水楊酸是其有效成分，半衰期約為1 h，能在結腸部分有效蓄積，對結腸前列腺素、過氧化物酶及黏膜白三烯均有一定抑制作用，能抑制巨噬細胞遷移至結腸病灶部位，發揮抗炎、消除損傷因子作用［10,11］；研究表明，美沙拉嗪可有效減少因使用柳氮磺胺吡啶所產生的的胃腸道反應、肝腎損傷等不良反應［12］。

在疾病機制研究中，建立良好的腸道炎癥動物模型對研究UC 發病機制及美沙拉嗪的療效具有重要意義。常用TNBS/乙醇法誘發大鼠體內免疫與炎癥反應建立潰瘍性結腸炎動物模型，其病理表現與人類UC 相似。本研究發現，TNBS 造模成功后，結腸炎模型組大鼠活動狀況及體質量下降明顯，CMDI 評分升高且結腸組織出現明顯損傷，符合UC 臨床表現。經治療后，美沙拉嗪組大鼠的一般狀況與體質量均有明顯上升，DAI、CMDI 和TDI評分明顯降低，鏡檢結腸總體形態與HE 染色呈現的結腸再生黏膜厚度與黏膜肌缺損寬度均有明顯改善，同時結腸上皮細胞凋亡數量明顯減少，美沙拉嗪高劑量組治療效果更佳，提示美沙拉嗪可顯著改善UC 大鼠的病理損傷情況，保護結腸黏膜完整性，發揮治療潰瘍性結腸炎作用。

綜上所述，美沙拉嗪能顯著改善TNBS 誘導的潰瘍性結腸炎大鼠結腸組織形態及病理變化，通過對結腸黏膜屏障的保護、腸上皮細胞的凋亡及免疫失衡的調節作用，發揮治療UC 作用。