美沙拉嗪對(duì)結(jié)腸炎大鼠腸黏膜完整性的影響

陳云，謝軍，黃才斌，葉菁,2*

1.贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，江西 贛州 341001；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)，南昌 330004

炎癥性腸病（Inflammatory Bowel Disease，IBD）是一種病因不明的慢性非特異性結(jié)腸炎癥疾病，包括潰瘍性結(jié)腸炎（Ulcerative Colitis，UC）與克羅恩病（Crohn's Disease，CD），其中UC 患者臨床常表現(xiàn)出反復(fù)性腹痛、腹瀉、黏液濃血便等癥狀，該病遷延不愈，嚴(yán)重影響患者生命質(zhì)量［1,2］。臨床治療UC 的傳統(tǒng)藥物如柳氮磺胺吡啶水楊酸制劑、免疫抑制劑及糖皮質(zhì)激素等雖具有明顯療效，但臨床副作用較多［3］。美沙拉嗪是治療IBD 的常用一線藥物，對(duì)于初發(fā)型輕中度病變的治療，療效明顯；隨著基礎(chǔ)研究的深入，發(fā)現(xiàn)其保護(hù)結(jié)腸上皮完整性與UC發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切［4］。因此，本研究探討美沙拉嗪對(duì)UC 模型大鼠腸黏膜完整性的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)SD 大鼠40 只，雌雄各半，體重（200±20）g，由贛南醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。大鼠飼養(yǎng)于贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院SPF 級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，溫度20～25 ℃，相對(duì)濕度50～70%，自由飲食飲水，12 h/12 h 晝夜節(jié)律適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后進(jìn)行造模實(shí)驗(yàn)。

1.2 試劑及儀器

5%的2,4,6－三硝基苯磺酸（Trinitro-Benzene-Sulfonic Acid,TNBS；美國(guó)Sigma 公司）；美沙拉嗪緩釋顆粒劑（法國(guó)愛(ài)的發(fā)制藥公司，規(guī)格：0.5 g×10袋）；10%水合氯醛（上海安妍生物有限公司）；TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）；石蠟切片機(jī)、攤片機(jī)、生物組織包埋機(jī)（德國(guó)萊卡公司）；生物熒光顯微鏡（日本Olympus 公司）。

1.3 研究方法

1.3.1 造模方法 采用TNBS/乙醇化學(xué)法誘導(dǎo)形成UC大鼠模型。對(duì)照組、結(jié)腸炎模型組、美沙拉嗪低劑量組、高劑量組，每組10 只，造模前均禁食1 d。用10%的水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉，隨后用聚丙烯管輕輕插入肛門(mén)，深度約8 cm，緩慢注入TNBS/乙醇混合溶劑（100 mg/kg），捏緊肛門(mén)5 min 左右，化學(xué)法誘導(dǎo)形成急性UC。造模7 d 后，隨機(jī)抽取2 只大鼠解剖觀察，病理結(jié)果顯示有小潰瘍面形成、充血水腫、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，提示造模成功。造模后24 h分組灌胃治療，對(duì)照組、結(jié)腸炎模型組給予0.9%生理鹽水，而美沙拉嗪低劑量組、高劑量組分別給予美沙拉嗪（100、150 mg/kg）灌胃治療。

1.3.2 標(biāo)本采集 每天記錄大鼠一般情況，并進(jìn)行疾病活動(dòng)指數(shù)（Disease Activity Index，DAI）評(píng)分。連續(xù)治療14 d 后，大鼠禁食24 h，稱重后麻醉，處死大鼠，顯微鏡觀察結(jié)腸病變情況及進(jìn)行結(jié)腸粘膜損傷指數(shù)（Colon Mucosal Damage Index，CMDI）評(píng)分；隨后取結(jié)腸病變部位與4%多聚甲醛溶液中固定，再脫水透明處理，接著行石蠟包埋、組織切片、HE 染色、封片等處理，置于生物倒置顯微鏡觀察組織有無(wú)潰瘍面、結(jié)腸絨毛排列、充血及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等病理變化，檢測(cè)結(jié)腸上皮厚度，行組織學(xué)損傷指數(shù)（Tissue Damage Index，TDI）評(píng)分。

1.3.3 觀察指標(biāo) 采用Olympus 顯微鏡觀察HE 染色切片上的結(jié)腸黏膜潰爛處，轉(zhuǎn)換高倍鏡觀察并取5個(gè)視野，用專業(yè)圖像分析軟件測(cè)量計(jì)算再生黏膜厚度與黏膜肌缺損寬度的平均值。

1.4 判定標(biāo)準(zhǔn)

DAI 評(píng)分包括體質(zhì)量下降分?jǐn)?shù)、便血分?jǐn)?shù)及大便性狀分?jǐn)?shù)，具體評(píng)分細(xì)則參考文獻(xiàn)［5］。CMDI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)細(xì)則見(jiàn)文獻(xiàn)［6］。TDI 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)文獻(xiàn)［7］。TUNEL 法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，凋亡細(xì)胞為棕色，正常細(xì)胞為藍(lán)紫色。細(xì)胞凋亡指數(shù)（AI）=（凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)）×100%。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

運(yùn)用SPSS 22.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）描述，進(jìn)行正態(tài)性與方差齊性分析；對(duì)正態(tài)分布數(shù)據(jù)，多組計(jì)量資料比較用One-Way ANOVA 分析，兩兩比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況及組織病理學(xué)改變情況比較

結(jié)腸炎大鼠給予美沙拉嗪灌胃治療2 周后，大鼠體重增加，毛色有光澤，活動(dòng)增加，糞便有顆粒狀或條狀，癥狀明顯改善。結(jié)腸炎模型組大鼠經(jīng)TNBS 誘導(dǎo)后第6 d 出現(xiàn)腹瀉、體質(zhì)量減輕及稀便；大鼠結(jié)腸組織出現(xiàn)腸管變粗和腸壁增厚，與腹腔內(nèi)組織粘連，結(jié)腸黏膜明顯充血水腫，甚至形成糜爛和潰瘍，見(jiàn)圖1。顯微觀察可見(jiàn)模型組大鼠結(jié)腸組織見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，炎癥累及結(jié)腸腸壁全層，腸黏膜腺體被破壞且分布雜亂，較多部位有糜爛以及潰瘍形成，見(jiàn)圖2。第14 d 天后模型組大鼠表現(xiàn)為慢性炎癥，大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，可見(jiàn)朗格漢斯巨細(xì)胞、肉芽腫形成、鋪路石樣改變。

2.2 各組大鼠DAI、CMDI、TDI 平均評(píng)分情況比較

使用TNBS/乙醇混合溶劑灌腸給藥后，模型組大鼠DAI、CMDI 和TDI 評(píng)分顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而美沙拉嗪低劑量組、高劑量組的上述評(píng)分明顯低于結(jié)腸炎模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠DAI、CMDI、TDI平均評(píng)分情況比較（，n=10） 分

表1 各組大鼠DAI、CMDI、TDI平均評(píng)分情況比較（，n=10） 分

注：與對(duì)照組相比，aP＜0.05；與結(jié)腸炎模型組相比，bP＜0.05；與美沙拉嗪低劑量相比，cP＜0.05。

2.3 各組大鼠再生黏膜厚度與黏膜肌缺損寬度比較

美沙拉嗪低劑量組與結(jié)腸炎模型組相比，結(jié)腸黏膜層缺損未出現(xiàn)明顯的再生修復(fù)，無(wú)明顯差異（P＞0.05）；美沙拉嗪高劑量組與結(jié)腸炎模型組相比，結(jié)腸黏膜層缺損有不同程度的修復(fù)與改善，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠再生黏膜厚度與黏膜肌缺損寬度比較（，n=10）

表2 各組大鼠再生黏膜厚度與黏膜肌缺損寬度比較（，n=10）

注：與結(jié)腸炎模型組相比，aP＜0.05；與美沙拉嗪低劑量組相比，bP＜0.05。

2.4 各組結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡情況比較

TUNEL 染色結(jié)果顯示，對(duì)照組結(jié)腸上皮細(xì)胞僅有少數(shù)凋亡，模型組結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡數(shù)量較多，而美沙拉嗪組結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡數(shù)量較模型組明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

UC 是一種難以治愈的慢性非特異性炎癥性疾病，病變部位集中于結(jié)直腸黏膜及黏膜下層，其臨床常表現(xiàn)為腹痛腹瀉、黏液膿血便［8］。該病病理機(jī)制尚不十分明確，研究認(rèn)為其可能與感染因素、遺傳因素、免疫調(diào)節(jié)劑、個(gè)人心理因素等相關(guān)，導(dǎo)致患者腸道黏膜生物屏障損壞改變，引起免疫調(diào)節(jié)紊亂，最終造成機(jī)體炎癥性損傷，因此保護(hù)腸黏膜完整性對(duì)治療UC 具有重要作用［9］。美沙拉嗪為臨床治療UC 一線用藥，5-氨基水楊酸是其有效成分，半衰期約為1 h，能在結(jié)腸部分有效蓄積，對(duì)結(jié)腸前列腺素、過(guò)氧化物酶及黏膜白三烯均有一定抑制作用，能抑制巨噬細(xì)胞遷移至結(jié)腸病灶部位，發(fā)揮抗炎、消除損傷因子作用［10,11］；研究表明，美沙拉嗪可有效減少因使用柳氮磺胺吡啶所產(chǎn)生的的胃腸道反應(yīng)、肝腎損傷等不良反應(yīng)［12］。

在疾病機(jī)制研究中，建立良好的腸道炎癥動(dòng)物模型對(duì)研究UC 發(fā)病機(jī)制及美沙拉嗪的療效具有重要意義。常用TNBS/乙醇法誘發(fā)大鼠體內(nèi)免疫與炎癥反應(yīng)建立潰瘍性結(jié)腸炎動(dòng)物模型，其病理表現(xiàn)與人類UC 相似。本研究發(fā)現(xiàn)，TNBS 造模成功后，結(jié)腸炎模型組大鼠活動(dòng)狀況及體質(zhì)量下降明顯，CMDI 評(píng)分升高且結(jié)腸組織出現(xiàn)明顯損傷，符合UC 臨床表現(xiàn)。經(jīng)治療后，美沙拉嗪組大鼠的一般狀況與體質(zhì)量均有明顯上升，DAI、CMDI 和TDI評(píng)分明顯降低，鏡檢結(jié)腸總體形態(tài)與HE 染色呈現(xiàn)的結(jié)腸再生黏膜厚度與黏膜肌缺損寬度均有明顯改善，同時(shí)結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯減少，美沙拉嗪高劑量組治療效果更佳，提示美沙拉嗪可顯著改善UC 大鼠的病理?yè)p傷情況，保護(hù)結(jié)腸黏膜完整性，發(fā)揮治療潰瘍性結(jié)腸炎作用。

綜上所述，美沙拉嗪能顯著改善TNBS 誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸組織形態(tài)及病理變化，通過(guò)對(duì)結(jié)腸黏膜屏障的保護(hù)、腸上皮細(xì)胞的凋亡及免疫失衡的調(diào)節(jié)作用，發(fā)揮治療UC 作用。