LncRNA UCA1靶向miR-206/CLOCK對神經膠質瘤細胞生長和侵襲的影響

呂洋 黃智 向雷 蔣天鵬 李興

(貴州醫科大學醫學影像學院，貴州 貴陽 550004)

神經膠質瘤是一種致命的腦腫瘤，其中80%為高度惡性[1]，它會影響腦功能，甚至危及生命[2]。據報道，長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA，lncRNA)是神經膠質瘤發生的關鍵調控因子[3]，包括CCAT1、ZEB1-AS1、TUG1和UCA1[4-6]。有研究發現長鏈非編碼RNA尿路上皮癌相關基因1(Long non-coding RNA urothelial carcinoma related gene 1，LncRNA UCA1)通過上調細胞周期蛋白D1的轉錄，來促進膠質瘤細胞的增殖[7]。據報道，miRNA-206可抑制膠質母細胞瘤的增殖[8]。然而，miR-206在神經膠質瘤中的生物學作用尚不明確。核心生物CLOCk是生物鐘與人類健康之間的重要環節，CLOCk異二聚體激活許多生物鐘蛋白的轉錄，它存在于許多組織中，比如前列腺、卵巢、結腸和心臟[9]，并且在腦組織中也有表達[10]。

既往研究表明，作為miR-206的效應因子，LncRNA UCA1可促進宮頸癌細胞的增殖、轉移和侵襲[11]，然而其與miR-206及其他相關RNA(CLOCk)的表達及生物學活性，特別是與膠質瘤功能的結合軸，尚未完全明確。本研究將探討LncRNA UCA1在miR-206和CLOCk上的表達及其對膠質瘤生長和細胞周期的綜合影響，擬為神經膠質瘤的治療提供一種新的策略。

1 材料與方法

1.1材料 U251、U87、SW1783、LN229神經膠質瘤細胞株和正常星形膠質細胞(normal human astrocytes ,NHAs)均購自上海組織銀行(上海，中國)。所有細胞保存在37℃和5%CO2濃度環境的DMEM和10%FBS培養基(Gibco，美國)中。本研究經我院倫理委員會批準，從我院病理科采集60例神經膠質瘤組織及周圍正常組織，所有患者在手術前未接受任何化療或放療，并對其組織出具書面知情同意書，組織均保存于液氮中。

1.2方法

1.2.1實時熒光定量核酸擴增法(Real-time Quantitative PCR，qRT-PCR) 總RNA通過PrimeScript RT試劑(Takara，日本)反向轉錄。采用SYBR Green Master Mix II(日本Takara，日本)在ABI7 300上進行qRT-PCR。miRNA的表達以U6為參考進行測定，并采用GAPDH進行校準。引物順序如下：LncRNA UCA1(正向5’-ACGCTAACTGGCACCTTGTT-3’和反向5’-TGGGGATTACTGGGGTAGGG-3’)、GAPDH(正向5’-GTCAACGGATTTGGTCTGTATT-3’和反向5’-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3’)、miR-206(正向5’-CGGGCTTGTGGA ATGGTAAGC-3’和反向5’-GCTTCGGCAGCA CATATACTAAAAT-3’)、U6(正向5’-CGCTTC ACGAATTTGCGTGTCAT-3’和反向5’-ATGGAA CGCTTCACGA-3’)。

1.2.2轉移和侵襲實驗 在無血清培養基中，將10 000個細胞加入上室進行轉移實驗。培養基置于下室。培養1 d后，使用0.1%結晶紫固定并染色?？梢苑治銮忠u能力。侵襲實驗中，在添加物的上室預涂50 mg/L基質凝膠。此外，所有其他步驟均相同。

1.2.3慢病毒載體轉染 將U251細胞和SW1783細胞共轉染慢病毒質粒，與LncRNA UCA1序列shRNA一同構建。LV-con為對照組。將慢病毒載體加入LncRNA UCA1片段構建LV-LncRNA UCA1。miR-206模擬或陰性對照(NC)通過Lipo- fectamine 2000(Invitrogen，美國)進行轉染。

1.2.4蛋白質印跡法 通過10%十二烷基硫酸鈉凝膠電泳提取蛋白質，并轉移至聚偏氟乙烯膜(Millipore，美國)?？笶-鈣粘蛋白抗體(1:500，ab40772，abcam)、N-鈣粘蛋白抗體(1:500，ab18203，abcam)、波形蛋白抗體(1:500，ab8978，abcam)、CLOCk抗體(1:500，ab201974，abcam)和GAPDH抗體(1:500，ab-8245，abcam)均購自美國abcam。采用化學熒光法(細胞信號技術)對反應進行測定。

1.2.5熒光素酶報告程序 將結合LncRNA UCA1-WT或LncRNA UCA1-MUT的miR-206亞克隆到pGL3堿性載體上。miR-206激動劑與10μg pLUC-WT-LncRNA UCA1或pLUC- MUT-LncRNA UCA1共轉染。將結合CLOCk-WT或CLOCk-MUT的miR-206亞克隆到pGL3堿性載體上。miR-206激動劑與pLUC-WT-CLOCk或pLUC-MUT-CLOCk共轉染。

1.2.6免疫熒光染色法及RNA免疫沉淀法(RNA immunoprecipitation protocol，RIP) 采用4%多聚甲醛固定細胞，采用0.2%Triton X-100進行滲透和1.5%正常驢血清進行阻隔。初級抗體結合1 h，隨后與Alexa Fluor488連結二級抗體再培育1 h。采用DAPI給細胞核染色，使用熒光顯微鏡測量熒光(Carl Zeiss，德國)。RIP采用人類抗Ago2抗體、磁珠(Millipore，美國)或對照抗體(Millipore，美國)對細胞進行了裂解和培育。

1.2.7體內腫瘤實驗 本研究經我院動物實驗倫理委員會批準，使用18只6周齡的雌性BALB/c裸鼠。在裸鼠前背部，6只注射U251細胞(5X106/每只)，6只注射感染LV-sh-LncRNA UCA1的U251細胞(5X106/每只)，6只注射感染LV-sh-con的U251細胞(5X106/每只)。每7 d記錄一次腫瘤大小，6周后對小鼠進行頸椎脫位麻醉。

1.3統計學方法 采用SPSS 16.0軟件和GraphPad Prism(美國)，將中位值用作為區分表達水平高低的臨界值，數據為至少三組實驗的平均值±標準差，采用單因素方差分析或t檢驗進行比較；采用F檢驗，以測量分類變量之間的差異；以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1LncRNA UCA1在神經膠質瘤組織和細胞系中的表達 通過qRT-PCR實驗發現，與正常組織相比，神經膠質瘤組織中LncRNA UCA1表達明顯上調(P<0.001)；LncRNA UCA1在U251、U87、SW1783和LN229細胞株中的表達與NHA相比，LncRNA UCA1呈過度表達(P< 0.01)；從0至60個月的長期隨訪發現，高LncRNA UCA1水平的患者的12個月生存率為86.96%，24個月生存率為60.87%，36個月生存率為56.52%，48個月生存率為47.83%，60個月生存率為30.43%，而低LncRNA UCA1水平的患者的生存率分別為100%，89.19%，83.78%，72.97%和59.46%，與低LncRNA UCA1水平的患者相比，高LncRNA UCA1水平的患者的生存率明顯降低。見(圖1a～圖1c)。

注：a：LncRNA UCA1在膠質瘤組織(n=60)和正常組織(n=60)中的相對表達；b：神經膠質瘤及正常細胞中的LncRNA UCA1表達；c：LncRNA UCA1水平在Kaplan Meier 0～60個月總生存曲線。(**P<0.01， ***P<0.001)圖1 LncRNA UCA1在神經膠質瘤組織和細胞系中的表達上調

2.2沉默LncRNA UCA1后對細胞運動和侵襲的影響 在U251和SW1783中轉染LV-sh-con和LV-sh-LncRNA UCA1基因后發現LncRNA UCA1下調抑制了神經膠質瘤細胞的轉移和侵襲，見(圖2a～圖2b)。蛋白質免疫印跡法和免疫熒光法的結果發現去除LncRNA UCA1能夠提高上皮標志物E-鈣粘蛋白的表達，但降低了N-鈣粘蛋白和波形蛋白的表達，見(圖2c～圖2d)。

注：a-b：U251和SW1783中轉染LV-sh-con和LV-sh-LncRNA UCA1的細胞侵襲實驗。c-d：U251和SW1783中轉染LV-sh-con和LV-sh-LncRNA UCA1的上皮標志物E-鈣粘蛋白、N-鈣粘蛋白和GAPDH的蛋白質印記和免疫熒光檢測。(**P<0.01)圖2 沉默UAC1抑制細胞的運動和侵襲

2.3miR-206是否為LncRNA UCA1的體外靶點 為了解miR-206和LncRNA UCA1之間的關系，我們對二者的共同序列進行了線上搜索并進行了熒光素酶分析，(圖3a)預測了LncRNA UCA1和miR-206的共同序列，并顯示了通過LncRNA UCA1-WT(野生型)或LncRNA UCA1-MUT(突變型)構建的熒光素酶報告劑。(圖3b)和(圖3c)分別顯示了LncRNA UCA1-WT&LncRNA UCA1-MUT和U251&SW1783中miR-206的熒光素酶活性，兩種細胞中LncRNA UCA1-WT中miR-206活動均受到顯著抑制(P<0.01)。LncRNA UCA1&miR-206和U251&SW1783組合中，IgG和Ago2的相對表達分別如(圖3c)和(圖3e)所示；RIP分析表明，與對照IgG團粒相比，Ago2團粒中LncRNA UCA1和miR-206表達更高(P<0.01)，見(圖3d)。根據上述結果，LncRNA UCA1、miR-206和Ago2之間的關聯得以確定，證實miR-206是LncRNA UCA1的體外靶點。

注：a：LncRNA UCA1與miR-06的共同序列以及LncRNA UCA1-WT或LncRNA UCA1-MUT的序列；b：在LncRNA UCA1-WT中轉染miR-206的細胞熒光素酶活性，在U251中轉染LncRNA UCA1-MUT的細胞熒光素酶活性；c：miR-206共轉染LncRNA UCA1-WT或SW1783共轉染LncRNA UCA1-MUT的細胞的相對熒光素酶活性；d ：LncRNA UCA1共轉染的細胞中IgG和Ago2的相對表達與U251中miR-206的相對表達；e：LncRNA UCA1和miR-206共轉染的細胞中IgG和Ago2的相對表達；(**P<0.01)。圖3 驗證miR-206是LncRNA UCA1的靶點

2.4CLOCk是否為miR-206的直接靶點 (圖4a)預測了CLOCk和miR-206之間的共同序列，并顯示了帶有CLOCk-WT(野生型)和CLOCk-MUT(突變型)的熒光素酶報告劑。(圖4b)和(圖4c)分別顯示了miR-206、miR-206和LV-LncRNA UCA1共轉染的CLOCk-WT和CLOCk-MUT在U251和SW1783細胞中的熒光素酶活性，與CLOCk-MUT相比，CLOCk-WT結合miR-206的熒光素酶活性明顯降低(P<0.01)。然而，觀察miR-206+V-LncRNA UCA1結果發現LncRNA UCA1減弱了這種作用。在miR-206和LV-shLncRNA UCA1轉染神經膠質瘤細胞中，CLOCk mRNA表達顯著降低，而在LV-LncRNA UCA1轉染神經膠質瘤細胞中有所增加，見(圖4d)；與qRT-PCR結果一致，蛋白質印跡法結果表明了同一趨勢，見(圖4e)。

a：CLOCk和miR-206的共同序列以及CLOCk-WT和CLOCk- MUT序列；b：miR-206激動劑或miR-206激動劑+ LV-LncRNA UCA1對U251的熒光素酶活性；c：與miR-206激動劑或miR-206激動劑+ LV-LncRNA UCA1共轉染SW1783細胞的相對熒光素酶活性；d：miR-206、LV-LncRNA UCA1和LV-sh-LncRNA UCA1細胞中CLOCk的mRNA表達；e：蛋白質印記檢測腦膠質瘤細胞中CLOCk蛋白的表達；(**P <0.01)。圖4 CLOCk是miR-206直接靶點

2.5體內去除LncRNA UCA1對神經膠質瘤的影響 轉染LV-sh-LncRNA UCA1組較轉染LV-sh-con組的腫瘤提交明顯減小，見(圖5a)；第0至42天的腫瘤生長曲線發現轉染LV-sh-LncRNA UCA1組較轉染LV-sh-con組的腫瘤生長明顯變慢，見(圖5b)；第42天的腫瘤重量轉染LV-sh-LncRNA UCA1組較轉染LV-sh-con組明顯減少，見(圖5c)；腫瘤組織中LV-sh-LncRNA UCA1抑制了CLOCk的表達(P<0.01)，見(圖5d)；沉默LncRNA UCA1能顯著降低CLOCk蛋白的表達(P<0.01)，見(圖5e)。

注：a：體內腫瘤共轉染LV-sh-con和LV-sh-LncRNA UCA1的生長結果；b：兩組腫瘤的生長曲線；c：兩組腫瘤重量的比較；d-e：CLOCk在LV-sh-con和LV-sh-LncRNA UCA1中的表達；(**P<0.01)。圖5 體內的沉默LncRNA UCA1對神經膠質瘤的抑制作用

3 討 論

先前的研究發現LncRNA UCA1與神經膠質瘤密切相關，其在膠質瘤樣本中的表達高于正常腦樣本中的含量，并通過靶向miR-122增強了膠質瘤細胞的增殖、轉移和侵襲[12]。本研究結果顯示，與正常組織相比，膠質瘤組織和細胞株中的LncRNA UCA1表達顯著增高，高LncRNA UCA1水平患者的總生存率低于低LncRNA UCA1水平患者，這與既往發現一致。He等人[13]聲稱，去除LncRNA UCA1抑制了膠質瘤細胞增殖和轉移，我們的細胞侵襲實驗、蛋白質印跡法和免疫熒光分析均表明去除LncRNA UCA1能夠抑制細胞的運動和侵襲。

本研究中，熒光素酶活性顯示，miR-206可作為LncRNA UCA1的體外靶點。據發現，miR-206參與諸多細胞活動，尤其是細胞生長和腫瘤發生[14]。Wang等人[15]報道，miR-206通過膠質瘤中的Otx2調節了神經細胞增殖及其凋亡；Hao等人[8]報道，miR-206通過BCL-2抑制了膠質母細胞瘤的發展。而本研究發現miR-206的轉染降低了mRNA在膠質瘤細胞株中的表達，為其在膠質瘤發展中的作用提供了補充證據。

miR-206表達的失調可能導致晝夜節律和輸出的改變，其能夠介導哺乳動物Clock的動力學機制[16]。本實驗轉染miR-206的CLOCk-WT的熒光素酶活性表明了CLOCk是miR-206的靶點。此外據報道，生物鐘的失調在許多疾病的發生和發展中起著關鍵作用，如人類癌癥[17]。本實驗LV-sh-LncRNA UCA1的蛋白質印跡法結果顯示，腫瘤組織中的CLOCk表達受到抑制。說明CLOCk的表達與miR- 206和LncRNA UCA1密切相關，而這二者可能對膠質瘤的發生和發展產生負面影響。

He等人[18]發現，LncRNA UCA1/miR-182/PFKFB2軸調節了膠質母細胞瘤相關細胞和膠質瘤侵襲,這說明多種遺傳標記物在人類腫瘤的相互作用和組合功能中可能是一個整體。本研究發現CLOCk蛋白在miR-206和LV-sh-LncRNA UCA1中表達較少，但在LV-LncRNA UCA1中表達顯著增加；此外體內腫瘤生長表明，去除LncRNA UCA1抑制了體內膠質瘤生長，而腫瘤組織中的CLOCk表達受到抑制。體內LncRNA UCA1的沉默抑制了膠質瘤的生長，而去除LncRNA UCA1顯著降低了CLOCk蛋白表達。上述結果表明，LncRNA UCA1/miR-206/CLOCk軸可以作為一個整體來調節神經膠質瘤細胞的增殖和侵襲。

4 結 論

LncRNA UCA1通過膠質瘤中miR-206/CLOCk軸增強了細胞的生長和侵襲，LncRNA UCA1/miR- 206/CLOCk軸可能是將來神經膠質瘤的一個潛在的新靶點。

(本文圖1、圖2見封三)