基于網絡藥理學和分子對接探討槲皮素治療冠心病的分子機制

徐江林，林 謙，劉 靜，萬 潔，崔曉云，紀 翔，毛天詩，張 卓，逯金金

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(CHD)簡稱冠心病，是由于冠狀動脈狹窄導致心肌細胞缺血、缺氧或壞死而引起的心臟病[1]。《中國心血管健康與疾病報告2019概要》指出，我國有約1 100萬例心力衰竭病人，患病率、死亡率均呈上升趨勢[2]。冠心病嚴重影響病人生活質量，給社會、經濟帶來巨大負擔，且長期單純使用西藥治療存在一定的副作用。近年來，新藥研發領域方面，天然藥物化學成分受到學者重視，天然產物是治療疾病和研發藥物的重要化合物來源[3]。槲皮素(Quercetin)又稱為槲皮黃素、櫟精，是一種天然黃酮類化合物，廣泛存在于自然界中，可從植物花、葉、果實中提取得到，且存在于多種中藥中，如黃芪、三七等。現代藥理研究表明，槲皮素通過抗氧化、抗炎等作用減輕冠心病心臟損傷[4]。目前關于槲皮素治療冠心病的作用機制尚不明確。網絡藥理學是一種新型的藥物研究方法，可全面、系統地分析藥物與疾病的關系，為研究藥物內部復雜的分子機制提供有力的工具[5]。本研究基于網絡藥理學，探討槲皮素治療冠心病的分子機制，為今后基礎研究提供新思路。

1 資料與方法

1.1 槲皮素潛在靶點的獲取 通過中藥系統藥理學數據庫和分析平臺[Traditional Chinese Medicine System Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)][6]、Pharm Mapper (http：//www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)數據庫[7]和Swiss Target Prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)數據庫[8]檢索及預測，通過UniProt數據庫(http：//www.uniprot.org/)校正靶點名稱為專業學術名稱，由此獲得槲皮素的潛在靶點。

1.2 冠心病的相關靶點收集 以“coronaryheart disease”為關鍵詞，分別檢索DisGeNET(http://www.disgenet.org/)[9]和GeneCards(https://www.genecards.org/)[10]數據庫，獲取冠心病相關靶點。

1.3 槲皮素治療冠心病的共同靶點 通過在線軟件作圖工具InteractiVenn構建Venn圖，得到槲皮素-冠心病的共同靶點。

1.4 蛋白質-蛋白質相互作用(protein-protein interaction，PPI)網絡構建 將槲皮素-冠心病共同靶點輸入STRING數據庫(https://string-db.org/)[11]，以高置信度(high confidence>0.7)進行篩選，隱藏網絡中無關聯節點，將結果文件保存為tsv格式，導入Cytoscape 3.7.2軟件，使用cytoHubba插件對PPI網絡進行分析，篩選槲皮素治療冠心病的關鍵靶點。

1.5 基因本體(gene ontology，GO)功能與京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析 將槲皮素-冠心病的共同靶點輸入Metascape數據庫(http://metascape.org/gp/index.html)[12]，進行GO功能與KEGG通路富集分析。GO功能分析得到生物學過程、細胞組分、分子功能和生物功能，用于描述基因靶點功能。KEGG通路富集分析得到槲皮素-冠心病共同靶點所富集的信號通路。

1.6 網絡構建 使用Cytoscape 3.7.2軟件，構建“槲皮素-共同靶點-冠心病”網絡和“槲皮素-關鍵靶點-主要通路-冠心病網絡”，槲皮素、冠心病和相關靶點以“節點”顯示，節點之間相互作用以“邊”顯示。使用Network Analyzer插件計算“槲皮素-關鍵靶點-主要通路-冠心病網絡”中節點自由度(Degree)。

1.7 分子對接 將得到的核心成分與關鍵靶點進行分子對接，得到對接親和力以反映分子間的結合穩固性。從PDB數據庫下載蛋白質分子結構，TCMSP下載化合物的結構，使用PyMol 2.4.0和Auto Dock Tools軟件對蛋白質、化合物進行處理，Auto Dock Vina軟件進行分子對接，PyMol 2.4.0進行可視化[13-14]。

2 結 果

2.1 槲皮素的潛在靶點 通過TCMSP、PharmMapper和Swiss Target Prediction數據庫檢索及預測，刪除重復數據后共得到459個槲皮素的潛在靶點。

2.2 冠心病的相關靶點 以“coronary heart disease”為關鍵詞檢索GeneCards和DisGeNET數據庫，收集靶點并去除重復數據后共得到2366個冠心病的相關靶點。

2.3 槲皮素-冠心病的共同靶點 將459個槲皮素潛在靶點和2 366個冠心病相關靶點輸入在線軟件作圖工具InteractiVenn，繪制Venn圖，取交集后共得到槲皮素-冠心病共同靶點233個。詳見圖1。

圖1 槲皮素-冠心病共同靶點的Venn圖

2.4 槲皮素-共同靶點-冠心病網絡 將槲皮素、冠心病及233個共同靶點輸入Cytoscape 3.7.2軟件，得到槲皮素-共同靶點-冠心病網絡，共235個節點和466條邊。詳見圖2。

圖2 槲皮素-共同靶點-冠心病網絡圖(綠色節點代表槲皮素，紫色節點代表冠心病，紅色節點代表共同靶點)

2.5 PPI網絡及槲皮素治療冠心病的關鍵靶點 使用cytoHubba插件根據Degree對PPI網絡進行分析，得到5個槲皮素治療冠心病的關鍵靶點，詳見表1。將槲皮素-冠心病共同靶點輸入STRING數據庫，通過高置信度(>0.7)篩選得到PPI網絡，網絡包含224個節點和1 915條邊，詳見圖3。

表1 槲皮素治療冠心病的關鍵靶點信息表

圖3 槲皮素治療冠心病的關鍵靶點

2.6 GO功能和KEGG通路富集分析 GO功能富集分析結果顯示，生物學過程主要集中在創傷反應(responsetowounding)、脂多糖反應(responseto lipopolysaccharide)、凋亡信號通路(apoptotic signaling pathway)、有毒物質反應(response to toxic substance)、細胞運動正調節(positive regulation of cell motility)；細胞組分主要集中在囊泡腔(vesicle lumen)、膜筏(membrane raft)、細胞外基質(extracellular matrix)、細胞頂端(apical part of cell)、細胞質核周區域(perinuclear region of cytoplasm)；分子功能主要集中在蛋白激酶活性(protein kinase activity)、內肽酶活性(endopeptidase activity)、輔因子結合(cofactorbinding)、激酶結合(kinase binding)、蛋白質同源二聚化活性(protein homodimerization activity)。KEGG通路富集分析結果顯示，通路主要富集在癌癥(pathways in cancer)、糖尿病并發癥晚期糖基化終產物(AGE)及其受體(RAGE)信號通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、MAPK信號通路(MAPK signaling pathway)、低氧誘導因子-1(HIF-1)信號通路(HIF-1 signaling pathway)、鉑耐藥(Platinum drug resistance)。詳見圖4。

圖4 GO功能和KEGG通路富集分析結果(排名前20)

2.7 槲皮素-關鍵靶點-主要通路-冠心病網絡 網絡中共17個節點和44條邊，綠色節點代表槲皮素，紫色節點代表關鍵靶點，紅色節點代表主要通路，黃色節點代表冠心病。節點的形狀和字體大小、顏色深度與Degree呈正相關。詳見圖5。

圖5 槲皮素-關鍵靶點-主要通路-冠心病網絡圖

2.8 分子對接分析 將槲皮素與5個關鍵靶點進行分子對接，得到平均對接親和力為-7.9 kcal/mol，詳見表2。對接親和力越小，提示配體與受體蛋白結合越穩定，表明槲皮素與關鍵靶點具有較強的結合力。槲皮素與AKT1分子對接結果最佳，對接模式見圖6。左側圖中黃色分子為槲皮素，顯示槲皮素可與AKT1中相互作用的氨基酸殘基形成界面的活性口袋分子匹配，右側圖片顯示對接部分的細節。

表2 分子對接結果

圖6 槲皮素與AKT1分子對接模式圖

3 討 論

冠心病歸屬于中醫學“胸痹”“真心痛”等范疇，基本病機以氣虛為本、血瘀為標。槲皮素是典型的天然黃酮類化合物，常用益氣活血中藥如黃芪、三七等治療，有研究表明，槲皮素通過降低氧化應激，抑制炎癥級聯反應，抑制體內細胞凋亡，保護心肌免受缺血再灌注損傷[15]。Dong等[16]發現，槲皮素可能通過下調HMGB1-TLR4-NF-κB信號通路，抑制細胞炎性因子產生，改善冠狀動脈結扎大鼠及H9C2細胞的缺血再灌注損傷，但深層機制需進一步探討。因此，本研究運用網絡藥理學方法探討槲皮素治療冠心病的分子機制。

本研究結果發現，槲皮素可能通過233個靶點作用于冠心病。通過對PPI網絡進一步分析，得到槲皮素治療冠心病的5個關鍵靶點，分別是AKT1、TP53、MAPK1、IL-6、VEGFA。AKT是調節多種細胞功能的復雜信號通路中心，分為3種亞型AKT1、AKT2和AKT3。其中，AKT1在心腦組織中表達最豐富，敲除AKT1基因導致動脈粥樣硬化小鼠模型的血管平滑肌細胞增殖、遷移減少，氧化應激誘導的細胞凋亡增加，增加斑塊易損性，導致嚴重動脈粥樣硬化和閉塞性冠狀動脈疾病[17]。AKT1通過AKT1-eNOS信號軸調控一氧化氮(NO)產生，減輕缺血再灌注對心肌細胞損傷[18]。TP53是一種抑癌基因蛋白，具有抑癌和調節細胞凋亡作用。TP53基因突變可抑制細胞凋亡導致動脈粥樣硬化，且與冠心病發生密切相關[19-20]。MAPK1基因又稱為細胞外信號調節激酶2(extracellular signal-regulated kinases，ERK2)基因，參與ERK1/2信號通路及增殖、分化、轉錄調節等多種細胞進程。相關研究表明，MAPK-1/HIF1/HO-1基因多態性與圍絕經期冠心病顯著相關[21-22]。Chen等[23]研究發現，抑制ERK1/2信號通路和激活肝X受體(liver X receptor)可能通過保護動脈完整性，防止巨噬細胞/泡沫細胞形成及增強膽固醇逆向轉運等多種機制減輕動脈粥樣硬化。IL-6是促炎性細胞因子的一種，參與各種炎癥和免疫反應，Bernberg等[24]研究發現，應激通過增加IL-6釋放進而促進動脈粥樣硬化發展。VEGFA是一種血管內皮生長因子，主要參與調控血管生成，Zou等[25]研究發現，VEGFA通過增加活性氧的生成及增強內質網應激介導的自噬，促進急性心肌梗死后血管生成，從而改善缺血性心肌病。

KEGG通路分析主要富集在癌癥、糖尿病并發癥晚期AGE及其受體(RAGE)信號通路、MAPK信號通路、HIF-1信號通路、鉑耐藥。持續性高血糖形成蛋白內交聯而產生AGEs，AGEs直接參與動脈粥樣硬化和細胞內信號傳導的調節，對內皮細胞反應、血管平滑肌細胞功能和血小板活性產生有害作用，增強炎癥和氧化應激，在冠心病的病理生理中發揮重要作用[26-28]。MAPK信號通路包括4個級聯反應：p38-MAPKs、Jun氨基末端激酶(JNK)、細胞外信號相關激酶1/2(ERK1/2)和細胞外信號調節激酶5(ERK5)，調控細胞生長、炎癥、凋亡和應激反應等多種過程[29]。相關研究發現，p38-MAPK的激活通過磷酸化活化核因子-κB(NF-κB)，促使血管內皮細胞過度表達促炎細胞因子，加重炎性損傷，促進動脈粥樣硬化發展[30]。HIF-1廣泛參與多種細胞信號通路，是介導缺氧信號傳導的中樞，其中HIF-1α主要調節氧氣穩態，在缺氧性損傷中發揮重要作用[31]。冠心病病人HIF-1α蛋白表達增加，與冠心病的發生密切相關[32]。Liu等[33]研究發現，過表達miR138靶向HIF1-α，可抑制心肌缺血再灌注損傷誘導的線粒體凋亡，從而減小心肌缺血再灌注損傷導致的心肌梗死范圍。癌癥通路包括MAPK信號通路、VEGF信號通路、p53信號通路、PI3k-AKT信號通路等。持續激活JNK和ERK1/2通路可增加癌細胞對鉑類藥物的耐藥性[34]。

GO分析中，生物學過程主要與創傷反應、脂多糖反應、凋亡信號通路、有毒物質反應、細胞運動正調節相關，與上述通路介導的生物學過程相符。分子對接結果顯示，所有對接配對具有良好的對接親和力，從分子角度進一步驗證了槲皮素對冠心病靶點的調節作用，同時證明網絡藥理學的可靠性。

綜上所述，本研究通過網絡藥理方法探討槲皮素治療冠心病的潛在機制，確定槲皮素治療冠心病的關鍵靶點、主要生物學過程及主要通路，為基礎研究提供方向。