康達心口服液對射血分數保留心力衰竭大鼠心肌纖維化的影響

吳 翔，張婷婷，喬建峰，熊尚全

射血分數保留心力衰竭(ejection fraction preserved heart failure，HFpEF)是以心臟舒張功能受損為主要表現的臨床綜合征。目前，HFpEF在心力衰竭病人比例已超過50%，且呈升高趨勢。如何有效延緩和逆轉HFpEF病人進程，改善轉歸，已成為慢性心力衰竭治療的最大挑戰[1]。中醫藥治療HFpEF療效確切，本研究通過構建HFpEF大鼠模型，基于心肌纖維化角度，探討康達心口服液對HFpEF大鼠心肌纖維化的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 30只無特定病原體級(SPF級)SD大鼠，體重150～200 g，由福建中醫藥大學實驗動物中心提供。所有動物實驗過程均遵循動物倫理學相關規定。

1.1.2 實驗藥物與試劑 康達心口服液(福建中醫藥大學附屬人民醫院院內制劑)，主要成分：附子、黃芪、葶藶子、豬苓、當歸；轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)抗體一抗和二抗均購自美國CST公司；N末端B型鈉尿肽原(NT-proBNP)試劑盒購自美國Vigenebio公司。

1.1.3 實驗儀器 小動物呼吸機，TKR-200C廈門欣銳儀器儀表有限公司生產；Visual Sonic Vevo 2100?型小動物超聲成像系統，加拿大Visual Sonics公司生產。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型的建立 HFpEF模型：大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉后，高位結扎腹主動脈以復制動物模型。于大鼠腹部正中線開口，逐層開腹，暴露并分離腹主動脈，以大鼠右側腎動脈上方2～3 mm腹主動脈處為結扎點，使用4-0的帶針線結扎，造成腹主動脈結扎點內徑縮窄；結扎后心臟表面即刻給予利多卡因注射液1～2滴，縫合關閉腹腔；關腹后腹腔滴注2%的青霉素/鏈霉素溶液。術后第12周，即造模HFpEF大鼠模型。假手術組給予相同手術方法，穿線但不結扎腹主動脈。

1.2.2 實驗分組 將30只SD大鼠稱重后隨機分為3組：假手術組(sham組)、心力衰竭組(HFpEF組)、心力衰竭干預組(HFpEF+I組)。HFpEF+I組大鼠灌胃2.7 mL/(kg·d)康達心口服液；假手術組、心力衰竭組灌胃等量生理鹽水。3組大鼠均連續灌胃12周。

1.3 觀察指標

1.3.1 心功能評估 治療12周后，應用心臟超聲測量各組大鼠舒張早期二尖瓣血流速度與舒張晚期二尖瓣血流速度比值(E/A)、舒張早期二尖瓣血流速度與舒張早期二尖瓣環運動速度比值(E/e′)，評估大鼠心臟舒張功能，采用酶聯免疫吸附法檢測各組大鼠NT-proBNP水平，評估心功能。

1.3.2 心臟組織收集 處死大鼠前測量體重，處死后立即取出心臟，并測量心臟、左室重量，計算心臟重量/體重指數(Hw/W)、左室重量/體重指數(LVw/W)。取出1 mm3面積的心肌組織迅速置于10%的甲醛中固定24 h后，石蠟包埋組織切片(4 μm)，進行蘇木精-伊紅(HE)染色，并觀察心肌組織膠原纖維含量、分布及心肌纖維化。

1.3.3 心肌纖維化評估 分別提取各組大鼠心臟組織總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，并進行制膠、電泳、轉膜、封閉、抗體孵育、顯影，數據分析，應用Western Blotting分別檢測各組大鼠心臟組織TGF-β1蛋白表達水平。

2 結 果

2.1 3組大鼠心功能指標比較 與sham組比較，HFpEF組和HFpEF+I組大鼠E/A比值明顯降低，NT-proBNP水平、E/e′升高，差異均有統計學意義(P<0.05)；與HFpEF組比較，HFpEF+I組E/A比值升高，NT-proBNP水平、E/e′降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 3組大鼠心功能指標比較(±s)

2.2 3組大鼠心臟重量比較 與sham組比較，HFpEF組Hw/W、LVw/W均升高，差異均有統計學意義(P<0.05)；與HFpEF組比較，HFpEF+I組Hw/W、LVw/W均降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見表1。

2.3 3組大鼠心臟組織纖維化比較 電鏡下觀察各組大鼠HE染色心肌組織，與sham組比較，HFpEF組和HFpEF+I組大鼠心臟組織心肌纖維化程度增加；與HFpEF組比較，HFpEF+I組大鼠心臟組織心肌纖維化程度明顯減輕。詳見圖1。

圖1 3組大鼠心肌組織心肌纖維化程度

2.4 3組大鼠心肌組織TGF-β1蛋白表達比較 與sham組比較，HFpEF組和HFpEF+I組大鼠心臟組織TGF-β1蛋白表達均升高，差異均有統計學意義(P<0.05)；與HFpEF組比較，HFpEF+I組大鼠心臟組織TGF-β1蛋白表達明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見表1及圖2。

圖2 3組大鼠心肌組織TGF-β1蛋白表達

3 討 論

心肌纖維化導致心肌順應性下降是HFpEF重要的病理生理機制，心肌纖維化尤其是早期心肌纖維化多影響心臟舒張功能[2-3]。在心肌纖維化的發生發展過程中，組織內細胞外基質(extracellular matrix，ECM)異常增多和過度沉積發揮了關鍵作用[3]。TGF-β1促進心肌纖維化作用得到證實。TGF-β1通過調控心肌成纖維細胞和ECM代謝平衡，從而促進心肌纖維化及HFpEF發生發展[4-7]。將小鼠TGF-β1基因剔除后，其胚胎發生和發育中出現血管缺陷[8]，提示TGF-β1不僅參與維持正常內皮穩態[3]，而且在胚胎形成、纖維化和創傷愈合等過程中均參與血管發生[9-11]。

HFpEF屬中醫學“喘癥”“心水”“胸痹”等范疇，病機總屬本虛標實，心為“君主之官”，主血脈，心之氣陽不足，心血瘀阻，水飲內停，痰飲為陰邪，心腎陽虛不能化水，水飲上凌于心肺，則見氣促、咳嗽、咳痰，又常因外感、內傷、勞累等加重。相關研究發現，HFpEF以陽虛血瘀兼痰飲證者居多[12]。康達心口服液是福建中醫藥大學附屬人民醫院根據多年經驗方制成的院內制劑，君藥附子、黃芪溫腎暖土，益氣健脾；臣藥葶藶子、豬苓定逆止喘、滲泄水邪；佐藥當歸溫通血脈、活血行氣。前期研究已證實，康達心口服液治療慢性心力衰竭療效顯著，其可能機制為降低慢性心力衰竭病人血清基質金屬蛋白酶9水平，增強心肌收縮力，增加心排血量[13]；抑制細胞凋亡，降低腫瘤壞死因子α、白介素6水平，改善心臟重構等[14-15]。基于“溫陽益氣，化瘀利水”的治則，前期研究將康達心口服液應用于HFpEF病人的治療，結果發現，在標準治療基礎上聯合康達心口服液能降低HFpEF病人E/e′，升高E/A比值，并降低血清NT-proBNP水平[16]。

本研究通過建立HFpEF大鼠模型，結果證實：康達心口服液可降低HFpEF大鼠E/e′比值，升高E/A比值，并降低血清NT-proBNP水平。進一步研究發現康達心口服液能降低HFpEF大鼠心臟組織TGF-β1表達，這可能是康達心口服液抑制心肌纖維化，改善心臟舒張功能的機制。今后將進一步探討康達心口服液對心肌組織TGF-β1相關信號通路的影響，揭示康達心口服液治療HFpEF的具體機制。