血清NOx、ADM、ADPN聯合檢測對急性缺血性腦卒中病人腦血管事件再發的預測價值

宋春梅，席緒明，顏玉蘋，仰 炯

急性缺血性腦卒中約占腦卒中的80%，是發達國家第4大常見死因，也是導致病人殘疾的主要原因[1]。有缺血性中風病史的病人中風復發和其他心血管事件風險也增加。因此，準確識別腦血管事件再發是實施二級預防的必要條件。近年來多項研究顯示，一些生物標志物對腦卒中病人腦血管事件再發具有預測價值。一氧化氮(NO)在生理系統中具有多種功能，尤其在血管系統和中樞神經系統。腦組織過量產生NO，通過氧自由基參與神經毒性，導致細胞死亡和血腦屏障破壞[2]。腎上腺髓質素(ADM)作為血管緊張素Ⅱ的功能性拮抗劑，具有抑制醛固酮分泌，補償腎素-血管緊張素-醛固酮系統作用，維持血管完整性，近年來用于心腦血管疾病的檢測[3]。脂聯素(ADPN)參與眾多與動脈粥樣硬化發展相關的途徑，如糖脂代謝、炎癥、內皮功能、血栓形成等，是心血管疾病的獨立危險因素[4]。本研究檢測急性缺血性腦卒中病人血清NO代謝物(NOx)、ADM和ADPN水平，觀察其在急性缺血性腦卒中病人的變化及預測腦血管事件再發的臨床價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015年1月—2017年12月在我院住院的急性缺血性腦卒中病人107例。入選標準：急性缺血性腦卒中經MRI/CT檢查確診，符合全國第四屆腦血管病學術會議制定的急性缺血性腦卒中診斷標準；發病時間<24 h；病人及家屬對本研究內容知情同意，自愿入組。排除標準：既往有腦血管意外病史；既往有嚴重肺部、心血管系統疾病病史；慢性腎病病史；應用免疫抑制或糖皮質激素等。其中男57例，女52例，年齡(68.2±9.8)歲；顳葉梗死26例，顳葉+額葉梗死19例，基底節區梗死27例，顳葉+頂葉梗死10例，額葉梗死7例，額葉+頂葉梗死12例，枕葉梗死6例，所有病人均伴有不同程度的神經功能缺損。選擇同期健康體檢者107名作為正常對照組，其中男57名，女50名，年齡(67.1±9.1)歲。兩組性別、年齡比較，差異無統計學意義(P>0.05)。本研究經醫院醫學倫理委員會批準，符合醫學倫理學要求。

1.2 神經功能缺損程度評估 采用美國國立衛生研究院卒中量表(NIHSS)評分評估神經功能缺損情況，包括意識水平、指令配合度、眼球活動、視野缺損、面部表情癱瘓程度、肢體運動障礙程度、共濟失調、語言表達情況等11項，各項累加得分，總分42分，其中0～3分為輕型腦卒中。

1.3 血清NOx、ADM、ADPN檢測 病人入組后第1天、第3天及第7天采集空腹靜脈血，低溫分離血清，檢測NOx、ADM和ADNP，其中NOx檢測采用比色法，檢測儀器為721型分光光度計，檢測波長為450 nm，試劑盒購自上海鈺博生物科技有限公司；ADM和ADNP檢測采用酶聯免疫吸附法，檢測儀器為Multiskan FC型酶標儀，試劑盒購自上海澤葉生物科技有限公司。檢測過程嚴格按照試劑和儀器使用說明書進行。

1.4 隨訪 病人均規律隨訪，方式為電話或門診，無失訪，隨訪時間6～18個月。

1.5 再次腦血管意外事件 再次腦血管意外事件指與本次腦血管意外事件類似或相關的缺血性腦卒中，不包括與腦梗死無關的腦出血、腦外傷或腫瘤等。

2 結 果

2.1 血清NOx水平檢測 與正常對照組比較，腦卒中病人第1天、第3天血清NOx水平降低(t值分別為6.698，4.562，P<0.05)；而第7天血清NOx水平無明顯變化(P>0.05)。NIHSS評分≥3分腦卒中病人第1天、第3天血清NOx低于NIHSS評分<3分病人(t值分別為3.914，3.476，P<0.05)。詳見圖1。

A為所有病人；B為NIHSS評分≥3分病人；C為NIHSS評分<3分病人。與正常對照組比較，*P<0.05；與B比較，#P<0.05。

2.2 血清ADM水平檢測 與正常對照組比較，腦卒中病人第1天血清ADM水平升高(t=-4.021，P<0.05)；而第3天、 第7天血清ADM水平無明顯變化(P≥0.05)。NIHSS評分≥3分腦卒中病人第1天血清ADM明顯高于NIHSS評分<3分病人(t=-3.525，P<0.05)。詳見圖2。

A為所有病人；B為NIHSS評分≥3分病人；C為NIHSS評分<3分病人。與正常對照組比較，*P<0.05；與B比較，#P<0.05。

2.3 血清ADPN水平檢測 與正常對照組比較，腦卒中病人第1天、第3天血清ADPN水平降低(t值分別為8.654，6.547，P<0.05)；而第7天血清ADPN水平無明顯變化(P>0.05)。NIHSS評分≥3分腦卒中病人第1天、第3天血清ADPN明顯低于NIHSS評分<3分病人(t值分別4.658，4.012，P<0.05)。詳見圖3。

A為所有病人；B為NIHSS評分≥3分病人；C為NIHSS評分<3分病人。與正常對照組比較，*P<0.05；與B比較，#P<0.05。

2.4 急性缺血性腦卒中病人腦血管事件再發相關影響因素分析 對107例急性缺血性腦卒中病人進行隨訪，48例病人發生腦血管事件，發生率為44.9%。急性缺血性腦卒中病人腦血管事件再發相關因素結果顯示：高血壓、糖尿病、高脂血癥、NIHSS評分、服用抗高血壓藥物、服用他汀類藥物和服用抗凝藥物是影響腦血管事件再發的危險因素。詳見表1。

表1 急性缺血性腦卒中病人腦血管事件再發相關因素分析 單位：例

2.5 急性缺血性腦卒中病人腦血管事件再發的Logistic危險因素分析 將高血壓、糖尿病、高脂血癥、NIHSS評分、服用抗高血壓藥物、服用他汀類藥物、服用抗凝藥物、第1天 NOx、第2天 NOx、第1天 ADM、第1天 ADPN、第2天 ADPN納入Logistic回歸模型，結果顯示：NIHSS評分、第1天 NOx、第1天 ADM、第1天 ADPN是急性缺血性腦卒中病人腦血管事件再發的獨立危險因素。將NIHSS評分、第1天 NOx、第1天 ADM、第1天 ADPN擬合成聯合指標，即Logit(P)=0.212+0.632×NIHSS評分-0.212×第1天 NOx+0.062×第1天 ADM-0.314×第1天 ADPN。以未再發腦血管事件病人作為陰性組，再發腦血管事件病人作為陽性組，3項指標聯合診斷腦血管事件再發的靈敏度為88.23%，特異度為94.12%，ROC曲線下面積(AUC)明顯高于第1天 NOx、第1天 ADM、第1天 ADPN各指標單獨檢測(Z值分別為6.219，8.267，5.216，P<0.05)。詳見表2。

表2 各指標聯合預測腦血管事件再發的診斷價值

3 討 論

缺血性腦卒中是致殘率較高的腦血管疾病，病人恢復期存在再次腦卒中風險，導致病人神經功能缺損加重及生活質量降低。再次腦卒中的發生除與危險因素控制有關，本研究結果顯示，高血壓、糖尿病、高脂血癥等基礎疾病、NIHSS評分及服用抗高血壓藥物、服用他汀類藥物和服用抗凝藥物為病人是否發生再次腦卒中相關因素，提示腦卒中發生后需針對危險因素給予充分干預，也應規律降脂、抗血小板等治療。再次腦卒中的發病過程中，腦血管功能相關的細胞因子參與此過程，并發揮重要作用。對病人發生再腦卒中風險進行有效評估及干預，是改善預后、降低再腦卒中風險的有效措施。

NO、ADM及ADPN是與血管功能密切相關的細胞因子，NO作為一種活性氧，過量NO通過抑制過氧化氫酶和細胞色素P-450，導致微摩爾濃度氧化應激，而過氧化氫酶和細胞色素P-450均參與細胞對氧化損傷的保護[5]。過表達NO抑制核糖核酸肽還原酶，此酶為DNA合成的限速酶，從而增加DNA損傷。因此，腺苷59-二磷酸核糖合成酶被激活，引起三磷酸腺苷(ATP)生產二磷酸腺苷核糖過程中耗盡，導致神經毒性細胞死亡[6]。過表達NO可逆性抑制線粒體呼吸復合物，尤其是細胞色素C氧化酶，致使短暫性呼吸電子傳輸紊亂和電子傳輸鏈中超氧化物泄漏增加[7]。超氧化物是有氧代謝產生的，在低濃度條件下由超氧化物歧化酶保持[8]。超氧化物不斷從線粒體中泄漏，或未超過線粒體超氧化物歧化酶水平，超氧化物在一定程度與NO發生反應，由此形成毒性化合物過氧亞硝酸鹽，后者對細胞色素氧化酶和ATP酶具有較強的抑制作用，導致線粒體呼吸不可逆抑制、ATP耗竭及細胞死亡[9]。NO是由內皮型一氧化氮合酶(eNOS)、神經元型一氧化氮合酶(nNOS)和誘導型一氧化氮合酶3種一氧化氮合酶異構體在不同細胞中產生。因此，NO不僅在內皮細胞和神經元中合成，還在吞噬細胞、中性粒細胞和活化的星形膠質細胞產生。NO可調節血管功能中的多種作用[10]，不僅引起血管舒張，還能抑制血小板黏附、聚集和白細胞與內皮細胞黏附，還可抑制血管平滑肌細胞增殖和低密度脂蛋白(LDL)氧化[11]。NO有助于保持血管結構完整性。本研究通過NOx檢測反映NO水平，與健康對照組比較，腦卒中病人第1天、第3天血清NOx水平明顯降低，在7 d后恢復； NIHSS評分≥3分腦卒中病人第1天、第3天血清NOx明顯低于NIHSS評分<3分病人，可一定程度反映病情嚴重程度。

ADM是Xie等[12]于1993年發現的一種肽類激素，是由52個氨基酸組成，含有環狀結構和C-端酰胺，兩者均與ADM受體結合。ADM基因位于第11號染色體，由4個外顯子組成。ADM生物學活性的關鍵決定因素之一是受體活性修飾蛋白組(RAMP)。RAMP 2或3與降鈣素受體樣受體(CRLR)結合賦予ADM受體的特異性，因此，RAMP和CRLR是ADM表達的關鍵。ADM最初是在嗜鉻細胞瘤中發現，進一步研究表明，它由許多其他組織/細胞合成，特別是內皮和血管平滑肌細胞，且由于ADM分子量較小，可在血液和間質之間自由擴散[13]。通過前激素(pro-ADM)的蛋白水解碎裂，形成甘氨酸延伸的非活性ADM，之后被酶從ADM-甘氨酸轉化為具有生物活性的ADM-酰胺。ADM受體和結合位點在體內廣泛分布，但在心臟血管和肺組織結合位點密度最高[14]。除了血管舒張作用外，ADM可維持內皮細胞完整性。各種刺激均可誘導ADM表達，其中之一為體積過載，血漿ADM增加反映液體體積過大。這可能是一種抵消反應的結果，由于ADM誘導的內皮屏障功能穩定限制組織液超載，而ADM系統破壞導致血管滲漏、全身和肺水腫[15]。本研究結果顯示，腦卒中發生第1天血清NOx水平明顯升高，且隨著NIHSS評分升高而不斷增高。

ADPN是由ADIPOQ基因編碼的247-氨基酸多肽，位于3q27染色體上，含有3個外顯子。ADPN是由脂肪細胞產生，通過其相應的受體AdipoR1和AdipoR2發揮作用，它們在骨骼肌、肝臟和脂肪組織中表達[16]。3種形式ADPN在血液中循環，即低分子量三聚體、平均分子量六聚體和高分子量聚合物。雖然高分子量聚合物具有較強的血管保護功能，但這3種異構體的確切作用尚不明確。一般人群血清ADPN水平存在較大差異，長期禁食和減肥后增加。相關研究表明，ADPN對葡萄糖穩態、脂質代謝和心血管系統具有有益作用[17]。ADPN通過激活過氧化物酶體增殖激活受體-a和-g及AMP激活的蛋白激酶通路增強胰島素敏感性[18]。ADPN促進骨骼肌游離脂肪酸氧化，并與胰島素協同作用，抑制肝臟葡萄糖生成。ADPN通過上調抗炎細胞因子，如白細胞介素(IL)-10、IL-1受體拮抗劑和抑制促炎細胞因子(如腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ)抑制全身炎癥。臨床研究顯示，低水平ADPN與超敏C反應蛋白水平有關[19]。ADPN通過抑制黏附分子(如細胞間黏附分子-1、血管細胞間黏附分子-1、E-選擇素)阻止單核細胞黏附于血管壁，具有抗動脈粥樣硬化的作用，可抑制巨噬細胞對氧化低密度脂蛋白攝取，進而轉化為泡沫細胞，同時抑制血管平滑肌細胞增殖。ADPN通過刺激一氧化氮產生改善內皮功能，同時防止內皮細胞凋亡，降低氧化應激[20]。本研究結果顯示，腦卒中病人發生第1天、第3天血清ADPN水平明顯降低，7 d后恢復正常，NIHSS評分≥3分腦卒中病人第1天、第3天血清NOx明顯低于NIHSS評分<3分病人。

本研究將NOx、ADM、ADPN與其他影響急性缺血性腦卒中病人腦血管事件再發的相關因素納入模型，建立腦血管事件預測模型，發現基于第1天 NOx、第1天 ADM、第1天 ADPN模型具有較高的靈敏度和特異度，預測再次腦卒中風險ROC曲線發現，術后第1天三者聯合檢測預測再次腦卒中AUC為0.851，高于各指標的單一檢測AUC，具有較高的預測價值。血管功能調節過程中，NOx、ADM、ADPN存在相互調控的關系，ADM激活血管一氧化氮/一氧化氮合酶通路，調節eNOS和代謝酶系活動[21]。ADPN可抑制脂肪細胞和巨噬細胞的炎癥通路，發揮抗炎作用；通過結合血管內皮細胞表面的AdipoR2受體，誘導NO和合成，并降低血小板聚集、白細胞黏附和血管平滑肌細胞增生[22]，與NO及ADM構成復雜的信號網絡，共同調控血管。

綜上所述，急性缺血性腦卒中病人發生再次腦卒中等風險因素較多，危險因素的干預及規律的治療可降低再次腦卒中風險，NOx、ADM、ADPN等細胞因子組成調控網絡，共同參與再次腦卒中發生過程，檢測NOx、ADM、ADPN可評估再次腦卒中風險，為干預策略的制定提供依據。