人卵巢組織玻璃化凍存方案優選的實驗研究

李曉虹，湯惠茹，李雨珊，曾玉翠，魏蔚霞，黃斌，杜輝，吳瑞芳，2*

(1.北京大學深圳醫院，深圳 518036；2.深圳市女性重大疾病早期診斷技術重點實驗室，深圳 518036)

世界衛生組織公布的《世界癌癥報告》顯示2018年全球新增860萬例女性癌癥患者，其中乳腺癌是最常見的癌癥類型，占女性癌癥病例的近1/4[1]。而約70%的育齡期女性在診斷為乳腺癌時仍有生育意愿[2]。眾所周知，大多數癌癥治療，如化療、放療或兩者的結合都是對性腺有生殖毒性的，導致患者在治療結束后出現卵巢早衰和不孕。因此卵巢組織凍存和移植具有廣闊的應用前景。玻璃化冷凍是一種快速的冷凍方法，它通過使細胞內外液態直接轉化為非晶體的玻璃化態，以減少細胞內外冰晶的形成。玻璃化冷凍不需要特殊的設備，節省了時間和成本，多年來該技術在卵巢組織冷凍的應用中取得了重大進展，目前已報道有通過卵巢組織玻璃化冷凍后自體移植妊娠的病例，其中已出生3例活產嬰兒，但卵巢組織玻璃化冷凍還缺乏標準化方案，玻璃化冷凍保護液的配比和濃度需要優化[3-5]。

本研究選擇4種公認適用于卵巢玻璃化冷凍保存液，建立液滴法直接觀察玻璃化凍存液在液氮中快速降溫和復融時的玻璃化程度，比較此4種凍存液保存凍融后的人卵巢組織的凋亡標志物細胞色素C(Cytochome C)與半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)的表達情況，以篩選優化的人卵巢組織玻璃化凍存液配方，為人卵巢組織冷凍技術提供實驗依據。

資料與方法

一、實驗材料

1.研究對象：選取2018年3月至2019年12月期間在北京大學深圳醫院因婦科疾病手術治療的患者卵巢組織。納入標準：年齡18～40歲之間，月經規律，因疾病需要行腹腔鏡或開腹卵巢囊腫剝除術或卵巢切除術的患者。排除標準：術前3個月曾口服激素類藥物、有放化療病史及卵巢早衰。

共收集到納入符合標準的4例患者卵巢組織。患者年齡為(32.8±4.2)歲，其中因乳腺癌行預防性雙側輸卵管卵巢切除術1例，卵巢顆粒細胞瘤行卵巢切除術1例，因卵巢畸胎瘤/卵巢子宮內膜異位癥囊腫行卵巢囊腫剝除術各1例。

2.主要試劑及儀器：乙二醇(EG)、二甲基亞砜(DMSO)、蔗糖、海藻糖(Sigma，美國)；4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)緩沖的M199培養基(Thermo Fisher Scientific，美國)；人工合成血清替代品(SSS)(Irvine Scientific，美國)；4%多聚甲醛(北京索萊寶)；Cytochome C兔多克隆抗體(BA0781)、Caspase-3兔多克隆抗體(BM3957)(武漢博士德生物)；即用型免疫組化Elivision TM super試劑盒(兔/鼠)、二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒(福州邁新生物)；玻璃化卵巢組織凍存液(Cryotissue Kit VT301/VT302，Kitazato，日本)、冷凍管(Corning，美國)、光學顯微鏡(Olympus，日本)、體式顯微鏡(Olympus，日本)、液氮儲存罐(Thermo Fisher Scientific，美國)。

二、實驗方法

1.卵巢組織的獲取、處理與分組：卵巢切除術者標本離體后立即剪下卵巢皮質，囊腫剝除術者剪下附于手術剝除的卵巢囊腫邊緣的正常卵巢皮質，置于盛有6 ml經HEPES緩沖的M199培養液(含20% SSS和100 μg/ml青/鏈霉素)的離心管中，15 min內去除卵巢組織血跡和髓質及肉眼可見的卵泡與黃體等周期性結構后，分割成(5～10)mm×10 mm×1 mm大小的組織塊，隨機分成5組，分別納入凍存組和對照組。參閱有關人卵巢組織玻璃化冷凍保存的文獻資料[6-8]，設計4組凍存組和1個對照組。以未經凍融處理的新鮮卵巢組織為對照組，不作凍存處理，直接進行后續試驗。4種不同玻璃化凍存液成分如下：A凍存液(A組)為含20% EG+20% DMSO+0.5 mol/L蔗糖+20% SSS+M199培養基[6]；B凍存液(B組)為含38%EG+0.5 mol/L海藻糖+6%SSS+M199培養基[7]；C凍存液(C組)為含15%EG+15%DMSO+0.5 mol/L蔗糖+20% SSS+M199培養基[8]；D凍存液(D組)為Cryotissue Kit VT301/VT302 商品成品，成分未知。

人卵巢組織凍存4周后，取出金屬網格載體，按蔗糖/海藻糖梯度解凍法復蘇人卵巢組織[3-5]，以4%多聚甲醛固定24 h后用于HE染色和免疫組化檢測。

2.液滴法觀察玻璃化凍存液狀態：將潔凈的液氮注入耐低溫的玻璃皿中，將金屬網格載體置于液氮中，用移液槍吸取500 μl凍存液，垂直滴在位于液氮中的網格載體上，將玻璃皿置于體式顯微鏡下，直接觀察凍存液在快速降溫過程中的玻璃化狀態；再將37℃的磷酸鹽緩沖液(PBS)注入玻璃皿2中，將玻璃皿2置于體式顯微鏡下，用鑷子夾持金屬網格載體，將凍存液的液滴迅速移入玻璃皿2中，直接觀察各組凍存液在37℃復融時的玻璃化狀態并拍攝記錄。凍存液在液氮低溫和復融過程中肉眼和顯微鏡下凍存液均保持透明狀為玻璃化狀態；凍存液在液氮低溫和復融過程中完全形成冰晶體，肉眼呈不透明白色，顯微鏡下呈現黑色鏡像為完全結晶；凍存液在液氮低溫和復融時部分形成冰晶體，肉眼呈半透明白色，顯微鏡下呈現部分黑色鏡像，部分仍然保持透明狀為部分結晶。

3.人卵巢組織形態學觀察：取卵巢組織固定24 h后，常規石蠟包埋切片，制作厚度3 μm連續切片，每隔5張取一張進行HE染色，鏡下觀察。每次實驗任意選取3張切片，共進行4次獨立重復實驗。在400倍顯微鏡下，每張切片任選5個視野根據卵泡形態的正常與否進行卵泡計數。正常的卵泡為包含一個完整的卵母細胞和排列整齊的顆粒細胞層，卵母細胞或顆粒細胞未見濃縮核；出現卵母細胞皺縮或核固縮、顆粒細胞排列紊亂、顆粒細胞與卵母細胞分離或與卵泡周圍的基膜分離及基底膜不完整中任一項，就表明卵泡退化，視為形態結構異常卵泡。正常卵泡率=正常卵泡數/卵泡總數×100%。

4.免疫組化染色：選擇相應抗體對作為細胞凋亡標志物的Cytochome C和Caspase-3進行免疫組化染色。將組織凍融后及對照組卵巢組織切片分別以1∶200稀釋的兔抗人Cytochome C抗體和Caspase-3抗體4℃孵育過夜，復溫后PBS洗3次，每次3 min，二抗選自即用型免疫組化ElivisionTM Super試劑盒，操作步驟如說明書。DAB顯色后用蘇木素進行核復染，梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。顯微鏡下觀察拍照。每次實驗中各組對每個指標分析3張切片，每張切片在隨機選取5個視野計數所有陽性細胞的數目。Cytochome C陽性結果為細胞漿或者細胞核出現棕黃色顆粒。采用Image Proplus軟件根據染色部位著色深淺分析Cytochome C陽性表達并計算平均累積光密度，平均累積光密度=IOD(SUM)/Area(SUM)。Caspase-3陽性結果為細胞核染成棕黃色，陽性率=陽性細胞/總細胞數×100%。

三、統計學分析

采用SPSS 20.0軟件進行數據統計分析。非正態分布的數據以中位數(四分位間距)[M(P25，P75)]表示，組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)Kruskal-Wallis法；計數資料用百分率(%)表示，組間分析比較采用卡方檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、各組凍存液在快速降溫和復融時的玻璃化比較

在液氮中快速降溫時A、B和D組凍存液均保持完全的玻璃化狀態，玻璃液C凍存液大部分為玻璃化狀態，僅周邊見少許黑色的結晶形成(圖1)。在復融過程中，A、B和C組凍存液出現大塊黑色的結晶，隨著溫度上升，黑色結晶逐漸消失；D組凍存液則在整個復融過程中絕大部分保持透明的玻璃化狀態，只有少量黑色結晶(圖2)。

二、各組凍融后人卵巢組織形態學結果

HE染色顯示，各組卵巢組織均可見正常形態的卵泡和閉鎖卵泡，絕大部分卵泡在凍融后可以維持正常的形態。凍存組的異常卵泡表現為卵泡形態不規則，顆粒細胞分散、不連續，核固縮，基底膜斷裂等(圖3)。由于凍存卵巢組織中初級卵泡和次級卵泡較少，僅統計原始卵泡的正常率，各組卵巢組織的原始卵泡正常率與對照組比較均無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

A～D示凍存液A～D組；箭頭示結晶圖1 各組凍存液在液氮快速降溫時的玻璃化比較(×10)

A～D示凍存液A～D組；箭頭示結晶圖2 各組凍存液在復融后的玻璃化比較(×10)

Ctrl：對照組；A～D示凍存液A～D組；箭頭示異常卵泡；scale bar=50 μm圖3 各組玻璃化凍存后人卵巢組織的形態學比較(HE染色)

表1 各組患者卵巢組織凍融后原始卵泡正常率(%)

三、各組人卵巢組織中凋亡特異性標志物的表達情況

1.各組人卵巢組織中Cytochome C的表達結果比較：各組人卵巢組織凍融后的卵泡中均可見Cytochome C的表達(圖4)。對照組、A、B、C和D組的平均累積光密度中位數分別為0.01、0.03、0.03、0.10和0.02；C組Cytochome C的表達顯著高于對照組和D組(P<0.05)，其余各組比較均無顯著性差異(P>0.05)(圖5)。

Ctrl:對照組；A～D示凍存液A～D組；箭頭示陽性染色；scale bar=50 μm圖4 各組患者卵巢組織中Cytochome C的表達(免疫酶標法)

注：與對照組比較，*P<0.05；與D組比較，#P<0.05圖5 各組患者卵巢組織中Cytochome C顯色統計結果

2.各組人卵巢組織中Caspase-3的表達結果：Caspase-3在對照組的卵巢間質細胞中基本不表達，卵泡可見弱陽性表達，在各凍存組間質細胞的細胞核中可見點狀表達，卵泡可見陽性表達(圖6)。C組Caspase-3陽性率顯著高于A、B、D和對照組(P<0.05)，其余各組間Caspase-3陽性率比較均無統計學差異(P>0.05)(表2)。

Ctrl：對照組；A～D示凍存液A～D組；箭頭示陽性染色；scale bar=50 μm圖6 各組患者卵泡中Caspase-3的表達(免疫酶標法)

表2 各組患者卵巢組織中Caspase-3陽性率(%)

討 論

玻璃化冷凍用高濃度的冷凍保護劑置換細胞中的水，通過快速降溫方式，使細胞內外的液態直接轉化為粘稠的非晶體玻璃化態，從而最大限度地降低了細胞內外冰晶的形成。目前玻璃化冷凍在卵母細胞、胚胎和精子的凍存中取得了很好的效果[9-11]，但卵巢組織的成分復雜，組織塊的體積也較大，適合于細胞的玻璃化冷凍方案可能并不完全適合用于卵巢組織的冷凍。以往大部分學者較多地從卵巢組織凍融后或移植后卵泡的形態學和超微結構等方面間接地優化玻璃液，操作過程繁瑣、費時費力[12]。

本研究通過液滴法，可以方便快速地觀察凍存液在快速降溫和復融時的玻璃化程度。肉眼觀察到玻璃化的溶液保持透明，而結晶溶液則是高度不透明的白色。顯微鏡下觀察，玻璃化的溶液呈透明狀，而結晶的溶液呈黑色。雖然我們可以通過液滴法方便直接地觀察不同凍存液在液氮快速降溫和復融時的玻璃化程度，但凍存液在組織中的玻璃化卻很難觀察到的。Paredes等[13]發現雖然外部培養基發生了結晶，但小鼠卵母細胞卻仍有很高的存活率，提出細胞的存活與外部培養基的玻璃化或結晶關系很小或沒有關系。這可能是因為卵母細胞或胚胎細胞質中含有大量的大分子(蛋白和核酸)，這將增強凍存液中滲透溶質的玻璃化能力。但卵巢組織塊不同于細胞或胚胎，組織塊的體積較大，內部結構也更為復雜，關于凍存液的玻璃化程度與其對卵巢組織的冷凍保存效果關系的研究目前尚未見報道。

本研究選擇的4種凍存液在相同的條件下，A、B和D組凍存液在液氮中可以保持完全玻璃化狀態，而C凍存液在液氮中不能保持完全的玻璃化狀態，出現部分結晶。其中A、B和C組凍存液的滲透性冷凍保護劑的總濃度不同，C組凍存液的總濃度為40%(20% EG和20% DMSO)，B組凍存液的總濃度為38%(38% EG)，C組凍存液的總濃度為30%(15% EG和15% DMSO)。通常認為玻璃化需要較高的冷卻速率或較高濃度的冷凍保護劑。在相同的條件下，凍存液的濃度越高，越容易形成玻璃化狀態，但高濃度的冷凍保護劑在置換細胞內的水的過程中，如果超過細胞的滲透耐受極限，將導致細胞內溶質的泄漏和不可逆的損傷[14]。因而在優化凍存液時，尋找合適的冷凍保護劑濃度非常重要。本研究中C組凍存液的滲透性冷凍保護劑的總濃度最低，C組人卵巢組織中的晚期凋亡指標Caspase-3的表達顯著高于A和B組，可能是由于C組凍存液在快速降溫時出現部分結晶，而這些冰晶會對組織細胞造成破壞，從而影響了冷凍保存效果。

在各組凍存液升溫復融過程中，我們觀察到升溫的最初幾秒鐘，A、B和C組凍存液均出現結晶，隨著溫度進一步上升后，冰晶才再次融解，而D組凍存液在整個復融過程中絕大部分能保持透明的玻璃態。Yavin等[15]研究發現凍存液的復融的過程其實比冷凍過程更為重要。在升溫復融的過程中，細胞內的小冰晶由于表面自由能的差異可以轉化為大冰晶即再結晶。Mazur等[16]在小鼠卵母細胞玻璃化冷凍后復融過程中，通過顯微鏡觀察到卵母細胞因細胞內的再結晶而呈現黑色，認為能否防止細胞內玻璃化的再結晶是卵母細胞能否存活的更關鍵因素。我們的實驗發現，雖然A、B和D組凍存液均能在液氮中保持玻璃化狀態，但只有D組凍存液在復融過程中可以絕大部分保持玻璃化狀態。雖然經過4組凍存液處理凍融后的卵巢組織的卵泡正常率與對照組比無顯著差異(P>0.05)，但D組人卵巢組織的卵泡早期凋亡指標Cytochome C和晚期凋亡的指標Caspase-3的表達均顯著低于C組(P<0.05)。正常情況下Cytochome C存在于線粒體內，參與線粒體呼吸鏈電子傳遞和細胞凋亡過程，但Cytochome C在細胞凋亡因素刺激下由線粒體內釋放到細胞質內，是細胞凋亡的關鍵環節。Cytochome C可以激活Caspase-3，使細胞進入不可逆的凋亡階段。我們的研究結果提示在快速降溫和復融中能夠保持良好玻璃化狀態的冷凍保護液比在快速降溫和復融時均不能保持完全玻璃化玻璃液的冷凍效果更好，組織凋亡更少，但體外實驗的結果還需要通過體內實驗來進一步證實。

綜上所述，本研究通過液氮液滴法可方便直觀地觀察凍存液在快速降溫和復融時的玻璃化狀態，并可將其用于人卵巢組織玻璃化凍存液的初篩。在快速降溫和復融時均能保持較好玻璃化狀態的D組(商品化成品)凍存液保護人卵巢組織細胞凋亡較少，效果優于C組凍存液。