非優質胚培養至第7天囊胚凍融移植成功獲得活產1例

屈春鳳，莫鳳明，韋霽蕓，班婷

(河池市人民醫院生殖醫學中心，河池 547000)

一、病例資料

女方，33 歲，2019年3月因繼發性不孕11年到我中心就診。患者自訴2004年足月順產1女，產后3個月放置宮內節育器避孕；2008年行取環術，術后月經規律，性生活正常，未避孕，但一直未孕。就診時，體質量指數26.7 kg/m2，基礎FSH 7.41 U/L，LH 5.79 U/L，AMH 6.32 ng/ml，B超監測排卵正常。2019年5月行子宮輸卵管造影提示雙側輸卵管通暢，染色體核型分析為46，XX，無基礎疾病，無不良孕史。

男方，38歲，2019年3月行精液檢查結果為精液量2.2 ml，精子濃度16.4×106/ml，精子活動率54.1%，前向運動精子率32.5%，正常形態精子率4%。2019年4月再次行精液檢查結果為精液量4.8 ml，精子濃度7.8×106/ml，精子活動率47.2%，前向運動精子率31.0%，正常形態精子率4%。兩次結果均提示為少弱精子癥，無煙酒嗜好，無基礎疾病史，染色體核型分析為 46，XY。

夫婦雙方曾于2019年7月在我院行第一周期人工授精助孕，精液處理后前向運動精子總數未達標(<10×106/ml)，患者及家屬簽字要求繼續行人工授精手術，但未孕。2019年8月在我院行第2周期人工授精助孕，精液處理后仍不達標，取消人工授精周期。于2019年10月轉體外受精-胚胎移植技術助孕，采用短效長方案進行降調節，注射用尿促卵泡素(珠海麗珠制藥)進行促排卵，2019年10月16日在陰道超聲引導下穿刺獲得5枚卵母細胞。取卵當天男方采用手淫法取精，將密度梯度離心法處理后的精子用于體外受精。體外受精4 h后，根據脫顆粒細胞第二極體出現情況進行成熟和受精判斷，發現5枚卵母細胞均為成熟卵母細胞(MⅡ)，立即對未受精的成熟卵母細胞行卵胞漿內單精子注射(ICSI)，獲得4枚正常受精卵。培養至第3天獲得2枚優質胚胎(8Ⅱ級胚胎)和2枚非優質胚胎(1枚5Ⅲ級，1枚4Ⅲ級)，新鮮移植 2 枚(8Ⅱ級)胚胎，剩余1枚5Ⅲ級和1枚4Ⅲ級進行囊胚培養。培養第5天未形成囊胚，第6天形成1枚I期囊胚，延長培養至第7天形成1枚4BC 囊胚，采用商品化玻璃化冷凍試劑及載體(KITAZATO，日本)，予以冷凍保存。

胚胎評分：卵裂期胚胎評級根據卵裂球數目、碎片、卵裂球的均勻程度等情況評估胚胎質量，第3天卵裂期胚胎細胞數為7～9個、碎片比例不超過20%的Ⅰ級和Ⅱ級胚胎為優質胚胎。囊胚評分參照 Gardner 評分系統[1]，第5～6天≥3BB評為優質囊胚，第5～7天≥3BC評為可用囊胚。

凍融胚胎移植患者內膜準備：新鮮移植失敗后，患者于2020年1月回我院行凍融囊胚移植。月經周期第2天行B超監測內膜，口服戊酸雌二醇片(拜耳，德國)2.0 mg/次，2次/d，6 d后增至6 mg/d，再6 d后增至8 mg/d；第17天開始肌注黃體酮(天津金耀藥業)60 mg/次，1次/d進行內膜轉化，內膜轉化第7天進行解凍囊胚移植。

復蘇移植：采用商品化玻璃化解凍試劑(KITAZATO，日本)進行胚胎復蘇。對解凍囊胚行透明帶激光打孔輔助孵化，于37℃、三氣培養箱內培養2 h，待囊腔擴張后移植。移植后口服14 d戊酸雌二醇片(拜耳藥業，德國)8 mg/d和雪諾酮(默克公司，英國)90 mg/d。第14天抽血查人絨毛膜促性腺激素為 1 746 U/L；第35天進行B超超聲檢查單胎妊娠，可見胎芽、卵黃囊及原始心血管搏動。孕42周時，順產一女嬰，體重3 600 g，嬰兒生命體征正常，新生兒評分9分。

二、討論

隨著囊胚體外培養體系的不斷優化，囊胚培養作為一種對胚胎發育潛能進一步篩選的方法，已被廣泛應用于臨床。大多數胚胎培養室常規將胚胎觀察培養至第5～6天，很少培養至第7天再利用。延長胚胎體外培養時間，雖然可淘汰沒有發育潛能或攜帶異常染色體和基因的胚胎，但也存在胚胎質量下降的可能性。D7囊胚形成率低，其質量不如D5、D6囊胚，且在冷凍過程中容易受到損傷，增加細胞DNA碎片量、促進凋亡基因轉錄，從而降低其發育潛能[2]。研究發現，胚胎在體外培養至第5～6天的囊胚形成率約為67%，培養至第7天的囊胚形成率僅為29%[3]。Hammond等[4]研究表明，體外培養至第5天、第6天和第7天的可用囊胚率分別為 65%、30%和5%，且僅少數患者在第7天有可用囊胚形成。目前多數學者認為，D5囊胚移植比D6囊胚移植可以獲得更高的臨床妊娠率及活產率[5-9]。郭娜等[10]研究發現，分別移植了D5囊胚、D6囊胚和D7囊胚的患者，其臨床妊娠率分別為60.81%、50.12%和29.17%，活產率分別為 50.69%、39.23%和18.75%。盡管與D5囊胚和D6囊胚相比，D7囊胚形成率較低，但進一步延長體外培養時間可以讓囊胚有更多被選擇的機會。Du等[11]研究發現，移植了15例整倍體D7囊胚，最終2例成功分娩，新生兒評分良好。最近，阮秋燕等[12]報道了1例凍融移植由第3天優質胚胎培養至第7天的囊胚，成功獲得活產的案例。本文報道的該例患者是凍融移植由第3天非優質胚胎(<6細胞Ⅲ級胚)培養至第7天的可用囊胚，最終成功單胎妊娠，順利分娩一名健康嬰兒。這說明將第3天發育遲緩、胚胎質量差的卵裂期胚胎延長培養至第7天再進行凍融移植，仍然可以獲得臨床妊娠和活產的機會。

近年來，利用植入前胚胎遺傳學非整倍體檢測(PGT-A)技術分析胚胎非整倍體性發現，發育緩慢的胚胎具有較高的非整倍體率。Su等[13]對1 966枚囊胚進行活檢分析，發現D7囊胚中63.3%存在染色體異常。既往研究也發現，囊胚的非整倍體率與囊胚發育速度具有相關性，隨著囊胚形成天數的增加其非整倍體率也隨之增高[14-15]。Whitney等[16]發現，與移植D5囊胚相比較，移植D7囊胚的患者流產率顯著升高，活產率顯著降低。然而Hiraoka等[17]比較了分別凍融移植D5、D6、D7囊胚的出生結局發現，三組的孕周、早產率和平均出生體重均無顯著差異，故認為不同天數形成的囊胚移植后可獲得相似的發育潛能。Du等[11]報道，與D5囊胚相比，凍融移植D7囊胚的活產率下降，但新生兒身體質量、畸形發生率和新生兒死亡率均無顯著差異。因此，這對于部分自身條件差、獲得可用胚胎較少且胚胎質量差、不能耐受再次IVF助孕的患者而言，將胚胎延長培養至第6天，可能是一種合適的策略，特別是在發育遲緩的情況下，可以繼續培養至第6天甚至第7天。但此類培養至第7天形成的囊胚面臨較高流產率的風險，其臨床應用的可行性和安全性存在較大爭議[13]。在利用這類胚胎進行凍融移植時，應和患者充分溝通，說明利弊關系。

選擇利用D7囊胚的 IVF患者僅占很小一部分，對此類囊胚移植臨床結局的報道也較少，雖然可以獲得臨床妊娠及活產機會，但其應用價值和安全性尚存在爭議，需要長期跟蹤隨訪后代健康來證實。