枸杞多糖的羧甲基化修飾及抗氧化性能

許春平，姚延超，白家峰，徐石磊，賈學偉，劉紹華

(1.鄭州輕工業大學 食品與生物工程學院，河南 鄭州 450000；2.廣西中煙工業有限責任公司 技術中心，廣西 南寧 530001)

0 引言

自由基是人體生命活動中各種生化反應的中間代謝產物，若自由基數量過多且未被消滅時，就會對機體造成不同程度的損傷，加速衰老，嚴重時可能誘發各種疾病，補充含抗氧化劑的營養物質可提高機體清除自由基的能力[1]。目前，對枸杞多糖的研究主要集中在抗衰老、抗氧化、免疫調節、降血糖、降血脂和抗癌等藥理方面[2-7]。文獻[8]將提取純化后的黃精多糖組分PSP1-A進行羧甲基化修飾，得到產物CPSP1-A，相同劑量下CPSP1-A的抗氧化能力和還原力強于PSP1-A，表明將多糖羧甲基化后抗氧化性能得到提高。文獻[9]通過響應面法優化羧甲基化龍眼肉多糖制備工藝，制備出龍眼肉多糖的羧甲基化產物CM-LYP，結果表明羧甲基的引入增強了龍眼肉多糖的抗氧化活性，并且CM-LYP具有更好的免疫調節作用。但是目前關于羧甲基化枸杞多糖抗氧化性能的研究未見報道。

本文以廣西產枸杞為原料，使用微波輔助酶解法提取枸杞多糖，并制備羧甲基化枸杞多糖，對枸杞多糖的結構特性進行了表征，研究并對比了枸杞多糖和羧甲基化枸杞多糖的抗氧化性能，以期為枸杞多糖和羧甲基化枸杞多糖在保健食品中的應用與開發提供科學依據。

1 試驗材料和方法

1.1 材料、試劑和儀器

材料：廣西枸杞。

主要試劑：乙酸乙酯(C4H8O2)、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(C18H12N5O6, DPPH)、吡啶(C5H5N)、三氯甲烷(CHCl3)、纖維素酶(β-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶)、正丁醇(CH3(CH2)3OH)、果膠酶(果膠裂解酶)、異丙醇(C3H8O)、三氟乙酸(CF3COOH)、氯乙酸(CH2ClCOOH)、30%(體積分數)過氧化氫(H2O2)均為國產分析純。

主要儀器：SCIENTZ-10N型冷凍干燥機(寧波新芝生物科技股份有限公司)；DGX-9143型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海福瑪實驗設備有限公司)；永磁直流電動攪拌器(上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司)；高效液相色譜儀(high performance liquid chromatograph, HPLC, Waters科技有限公司)；Nicolet5700 型傅里葉變換紅外光譜儀(Fourier transform infrared spectrometer, FTIR, 美國布魯克海文儀器公司)；尺寸排阻色譜-多角度激光光散射-示差折光聯用儀(size exclusion chromatography-multi-angle laser light scattering refractive index, SEC-MALLS-RI, 美國懷亞特技術公司)；MCR-3型微波化學反應器(上海予正儀器設備有限公司)；UV-17001C 型紫外分光光度計(上海鳳凰光學科儀有限公司)。

1.2 試驗方法

對枸杞進行人工篩檢，剔除發生霉變、蟲蛀的變質枸杞。參照文獻[10]的方法，使用減壓干燥法對枸杞進行預處理，然后粉碎。

1.2.2 枸杞多糖的提取

采用微波輔助酶解法[11]提取枸杞多糖，先將200 g枸杞粉末溶于3 000 mL蒸餾水中，使用微波預處理20 min，微波功率為300 W，常溫下放置3 h，過濾，將濾渣溶于1 500 mL蒸餾水中，重復提取1次。將兩次濾液合并后加入一定質量的纖維素酶(質量分數0.1%)和果膠酶(質量分數0.25%)浸提12 h，離心(4 000 r/min,15 min)，收集上清液，Sevage法除蛋白，使用體積分數為30%的H2O2進行脫色處理。透析5 d后濃縮。冷凍干燥，得到枸杞多糖。

1.2.3 羧甲基化修飾

準確稱取200 mg枸杞多糖，溶于25 mL異丙醇中，攪拌下加入體積分數為20%的氫氧化鈉10 mL，堿化處理3 h。將2.63 g氯乙酸溶于25 mL異丙醇中，再加入體積分數為20%的氫氧化鈉溶液10 mL，充分攪拌，緩慢滴加一半混合液于反應液中，攪拌3 h。升溫到60 ℃反應30 min。滴加另一半混合液于反應液中，在60 ℃下反應1 h。用濃度為0.5 mol/L的乙酸溶液調節反應液至pH=7。透析5 d，濃縮后冷凍干燥，得到羧甲基化的枸杞多糖。

1.2.4 羧甲基化取代度的測定

準確稱取10 mg 羧甲基化枸杞多糖，在烘箱中干燥1～2 h后，加入3 mL體積分數為70%的乙醇，充分混合均勻后在常溫下放置5 min。依次加入10 mL 蒸餾水、50 mL 0.5 mol/L 的NaOH溶液，攪拌至枸杞多糖溶解。用濃度為0.1 mol/L的鹽酸滴定，以酚酞為指示劑，使用文獻[12-13]的方法，計算紅色褪去時每毫克羧甲基化枸杞多糖所需鹽酸的用量和羧甲基取代度。

你們急個啥？老冬瓜說。老鱖魚可沒說要殺誰。他那把刀子，有一尺多長，鋒利著呢，刀片可也不薄，握在手里正好，沉甸甸的，滿有手感。

1.2.5 HPLC分析單糖組成

準確稱取20 mg枸杞多糖，加入到15 mL 2 mol/L的三氟乙酸中，在121 ℃條件下油浴攪拌4 h。旋蒸至溶液蒸干，加入2 mL甲醇，再次蒸干，重復3次。最后加入2 mL純水，搖晃均勻后用0.45 μm濾膜過濾，裝入液相小瓶待用。分別配制1 mol/L的葡萄糖、葡萄糖醛酸、半乳糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖和鼠李糖標準樣品。然后參照文獻[14]的方法進行試驗。

1.2.6 FTIR分析

稱取2～3 mg枸杞多糖，加入溴化鉀粉末，磨細之后壓片，使用傅里葉變換紅外光譜儀，在波長區間4 000～400 cm-1掃描紅外吸收值。

1.2.7 SEC-MALLS-RI分析

準確稱取20 mg枸杞多糖，溶解于5 mL質量分數為0.9%的氯化鈉溶液中，80 ℃攪拌至完全溶解，過 0.45 μm聚醚砜濾膜。流動相為質量分數0.2%的NaNO3和質量分數0.02%的NaN3，測試溫度為25 ℃，進樣量為100 μL，流速為0.4 mL/min。用Astra軟件進行數據采集和分析。

1.2.8 DPPH法檢測抗氧化性能

配制不同濃度的枸杞多糖母液于具塞試管中，分別加入2 mL質量濃度為0.1 g/L 的DPPH乙醇溶液，充分混勻，避光靜置30 min。將不同質量濃度的枸杞多糖母液分別加入無水乙醇溶液中作空白，以DPPH溶液作對照，在517 nm波長處測定各待測液的吸光度，采用文獻[15]的方法計算對DPPH·自由基的清除率。

1.2.9 羥基(·OH)自由基清除作用測試

利用芬頓(Fenton)反應原理，測定枸杞多糖及其羧甲基化衍生物對H2O2與FeSO4反應產生的羥基(·OH)自由基的清除能力。分別配制不同質量濃度的枸杞多糖溶液和羧甲基化枸杞多糖溶液，取樣品溶液1 mL，然后依次加入9 mmol/L的FeSO4溶液1 mL、9 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液1 mL，8.8 mmol/L 的H2O2溶液1 mL，充分混勻后37 ℃水浴30 min。以等體積的蒸餾水代替樣品溶液作空白組，以等體積的蒸餾水代替水楊酸作樣本組，在510 nm波長處測定各待測液的吸光度，采用文獻[9]的方法計算對·OH自由基的清除率。

2 試驗結果分析

2.1 羧甲基化取代度

通過微波輔助酶解法，從200 g枸杞粉末中提取得到枸杞多糖8.64 g，提取率為4.32%。對枸杞多糖進行羧甲基化修飾后，計算得到羧甲基化枸杞多糖取代度為0.43。

2.2 HPLC結果分析

圖1為HPLC分析枸杞多糖的單糖色譜圖。由圖1可知：從8 min開始，單糖成分開始分離，在25 min左右完成分離。通過與標準樣品色譜圖對比，可以確定樣品中所含的單糖有甘露糖、葡萄糖醛酸、阿拉伯糖、鼠李糖和葡萄糖等，再結合峰面積，使用面積歸一法，計算出各個單糖組分的摩爾分數。甘露糖、葡萄糖醛酸、阿拉伯糖、鼠李糖和葡萄糖的摩爾分數分別為40.05%、18.98%、18.34%、15.73%和6.90%。

2.3 FTIR結果分析

圖2為枸杞多糖和羧甲基化枸杞多糖的紅外光譜圖。由圖2可知：羧甲基化修飾后枸杞多糖的大部分特征吸收峰都發生了不同程度的移動，這是由枸杞多糖分子中羧甲基基團的引入所引起的。在3 432 cm-1和3 425 cm-1處為—OH的伸縮振動峰，2 970 cm-1和2 963 cm-1處為亞甲基C—H伸縮振動峰，這兩組特征峰為典型多糖類物質的特征峰，羧甲基化修飾后仍然保留了此特征吸收峰。1 641 cm-1處為—C—O—的非對稱伸縮振動，該吸收峰為強峰; 1 423 cm-1處為—C—O—對稱伸縮振動，該吸收峰為中強峰；1 368 cm-1處為O—H面內變角振動，該吸收峰為中強峰。而1 641 cm-1、1 423 cm-1和1 368 cm-1處的 3個吸收峰為—COOH—基團的特征吸收峰，證明羧甲基取代成功。

圖1 HPLC分析枸杞多糖的單糖色譜圖

圖2 枸杞多糖和羧甲基化枸杞多糖的紅外光譜圖

2.4 SEC-MALLS-RI結果分析

相對分子質量和相對分子質量分布是多糖最為關鍵的結構特性，很大程度上影響多糖的物理特性和化學特性，而多糖構象對于其物理特性和化學特性具有非常重要的作用。本文使用SEC-MALLS-RI系統測定了枸杞多糖的數均相對分子質量Mn、質均相對分子質量Mw、多分散系數Mw/Mn和均方根旋轉半徑Rg，結果如表1所示。枸杞多糖的數均相對分子質量為3.561×104，質均相對分子質量為5.059×104，均方根旋轉半徑為73.0 nm，多分散系數為1.421。多分散系數Mw/Mn的值用于說明聚合物(如多糖)的相對分子質量分布寬度，Mw/Mn的值越大，相對分子質量分布越寬。由表1中枸杞多糖的多分散系數可知，提取出來的枸杞多糖相對分子質量分布較窄，分子結構比較均一[16]。

表1 枸杞多糖的SEC-MALLS-RI 測定結果參數表

2.5 DPPH·自由基清除率

圖3 枸杞多糖和羧甲基化枸杞多糖對DPPH·自由基的清除作用

圖3為枸杞多糖和羧甲基化枸杞多糖對DPPH·自由基的清除作用。由圖3可知：枸杞多糖和羧甲基化枸杞多糖對DPPH·自由基均具有一定的清除作用，且與其質量濃度成正相關關系。當質量濃度小于1 mg/mL時，枸杞多糖和羧甲基化枸杞多糖對DPPH·自由基的清除率相差不大；當質量濃度大于1 mg/mL時，羧甲基化枸杞多糖對DPPH·自由基的清除率明顯高于枸杞多糖；當質量濃度達到5 mg/mL時，羧甲基化枸杞多糖對DPPH·自由基的清除率達到68.02%。

圖4 枸杞多糖和羧甲基化枸杞多糖對·OH自由基的清除作用

2.6 ·OH自由基清除率

圖4為枸杞多糖和羧甲基化枸杞多糖對·OH自由基的清除作用。由圖4可知：枸杞多糖和羧甲基化枸杞多糖均對Fenton反應產生的·OH自由基有清除作用，且與質量濃度成正相關。當質量濃度達到1.0 mg/mL時，枸杞多糖和羧甲基化枸杞多糖對·OH自由基的清除率分別為45.42%和56.22%。在相同質量濃度下，羧甲基化枸杞多糖對·OH自由基表現出更強的清除率，說明羧甲基的引入可以提高枸杞多糖對·OH自由基的清除能力。

3 結論

(1)使用微波輔助酶解法提取枸杞多糖，提取率為4.32%，并對枸杞多糖進行羧甲基化修飾，羧甲基化取代度為0.43。FTIR結果顯示羧甲基化成功。

(2)枸杞多糖主要由甘露糖、葡萄糖醛酸、阿拉伯糖、鼠李糖和葡萄糖這5種單糖組成。

(3)在相同質量濃度下，羧甲基化枸杞多糖抗氧化性能高于枸杞多糖。