時差成像系統對IVF-ET結局的改善及其優選模型初探

李國臻，耿亞松，楊志偉，陶林林，戴芳芳，鄭波

(邢臺不孕不育專科醫院/邢臺生殖與遺傳專科醫院，邢臺 054000)

體外受精-胚胎移植(IVF-ET)中為了獲得好的臨床結局，通常需要優選1～2枚胚胎移入子宮。迄今為止，根據不連續時間點觀察胚胎發育情況優選胚胎是最實用的經典方法，然而通過簡單的形態學評分并不能了解其卵裂過程的精確變化。雖然將胚胎多次移出培養箱觀察可以獲得更多發育信息，但長時間暴露于培養箱外會改變胚胎培養環境的溫度、濕度及氣體含量[1]。

時差成像 (time-lapse imaging，TLI) 系統克服了這一缺點，不僅能穩定胚胎培養條件，而且提供了一種動態評估胚胎發育潛能的新方法，然而如何規范的使用TLI技術目前還沒有達成共識，且相對于常規胚胎優選方案，TLI的使用是否確實能提高胚胎鑒別能力、使患者盡早獲得妊娠，尚存在爭議[2]，且人工智能尚不能完成TLI的胚胎優選，巨量的胚胎發育資料分析大大增加了胚胎學家的工作量，使TLI在輔助生殖中的應用受到局限。因此結合實際工作，我們提出了一種簡單的形態學結合動力學的胚胎優選方案，通過比較TLI培養與常規培養的胚胎結局和妊娠結局，嘗試探討TLI的臨床應用價值，以期為TLI技術在IVF-ET中的使用規范制定上提供參考。

材料和方法

一、研究對象

回顧性分析2019年6～11月在我院行IVF/ICSI-ET治療的610個周期。其中使用TLI系統培養的周期數為67例(TLI組)，新鮮周期移植34例；常規培養周期543例(常規組)，新鮮周期移植262例。納入標準：常規長方案促排卵后行IVF或ICSI；因女方輸卵管因素和卵巢高反應或男方因素接受輔助生殖治療；均為首次輔助技術助孕。排除標準：子宮內膜異位、盆腔炎等宮腔和盆腔病變；子宮畸形和染色體異常患者。

二、研究方法

1.胚胎培養：常規組的受精卵在預平衡6 h的蓋油卵裂培養液微滴中培養3 d。TLI組的time-lapse培養皿按照說明書制作，于受精后放入卵裂培養微滴中孵育3 d，兩組胚胎的培養環境均為6%CO2和5%O2，受精卵發育第3天盡量抽凈卵裂培養液，重新注入預平衡的囊胚培養液以達到半量換液的目的。

2.促排方案：采用常規長方案促排卵，女方在黃體期肌肉注射促性腺激素釋放激素激動劑(GnRH-a，達菲林，益普生，法國)，達到降調節要求后，給予重組促卵泡β素(普利康，Merck Sharp & Dohme，英國)或尿促性素(樂寶得，麗珠制藥)促排卵，定期通過陰道B超監測卵泡發育情況，當1/3卵泡直徑≥18 mm時肌肉注射HCG(麗珠制藥)5 000～10 000 U，36.5 h左右B超引導下經陰道穿刺取卵，卵冠丘復合體置于37℃、6%CO2培養箱中培養。

3.體外受精和胚胎移植：受精方式分為IVF和ICSI兩種。IVF受精：HCG后39～40 h體外受精，受精密度為2萬條精子每個卵母細胞，受精后4～6 h拆除卵子周圍顆粒細胞，觀察受精情況酌情行早補救ICSI。ICSI：HCG后40～42 h選擇成熟卵母細胞進行ICSI。在受精后第3天，根據卵裂球數目、大小和碎片等情況進行形態學評分：Ⅰ級為卵裂球大小均勻，形態規則，胞質均勻清晰，無碎片或碎片率<10%；Ⅱ級為卵裂球大小均勻或略不均勻，形態欠規則，無碎片或碎片率10%～20%；Ⅲ級為卵裂球大小不均，形態欠規則，碎片率20%～50%；Ⅳ級為卵裂球大小嚴重不均，碎片率>50%。級別在Ⅲ級及以上的胚胎為D3可用胚胎。

4.胚胎優選方案：常規胚胎優選方案選擇正常受精、胚胎形態學評分最優的1～2枚胚胎移植入子宮。TLI組結合胚胎形態學和動力學方案優選胚胎，需移植前回查確保非多精受精來源胚胎，并盡量排除異常卵裂模式、PN轉換、逆卵裂等異常發育來源胚胎[3-4]；若不能根據形態學選擇出最好的胚胎移植或冷凍，以受精為起始時間注釋發育動力學參數：受精至二細胞時間(T2)、受精至三細胞時間(T3)，以及依次T4、T5、T6、T7和T8，通過比較實際分裂與理想時間的吻合度擇優移植或冷凍(表1)；若仍然無法區分出最好的胚胎，根據動力學參數CC1=T3-T2(8.5～14 h)、CC2=T4-T3(越短越好)、CC3=T5-T3(9～15 h)、S3=T8-T5(越短越好)優選胚胎[5-8]。

表1 不同受精方式的胚胎發育動力學理想時間(h)

5.黃體支持和妊娠確定：取卵當日即肌肉注射黃體酮注射液(浙江仙琚)進行黃體支持。視HCG注射日E2水平，移植日給予適量雌二醇(補佳樂，拜耳醫藥，德國)補充，移植當日常規使用黃體酮(安琪坦，博賞醫藥，法國)口服或陰道用藥進行黃體支持。移植后14 d查血HCG確定HCG陽性，移植后28 d行B超檢查，見孕囊確定臨床妊娠。

6.觀察指標：高齡占比(≥39歲患者數/全部患者數×100%)；可用胚胎數(取卵周期冷凍胚胎數+新鮮移植胚胎數)；D3可用胚胎(受精后第3天級別在Ⅲ級及以上的胚胎)；囊胚形成率(形成囊胚數/培養囊胚數×100%)；卵母細胞利用率(可用胚胎數/獲卵數×100%)；臨床妊娠率(臨床妊娠例數/移植例數×100%)；種植率(孕囊數/移植胚胎數×100%)。

三、統計學處理

結 果

一、兩組患者的基礎資料和胚胎結局比較

兩組患者間女方年齡、不孕年限、BMI、基礎FSH水平、HCG日激素水平、獲卵數、2PN數、可用胚胎數、優質胚胎數和囊胚形成率均無顯著性差異(P>0.05)；TLI組的卵母細胞利用率顯著高于常規組(P<0.05)(表2)。

表2 兩組患者基本情況和胚胎結局比較[(-±s)，%]

二、兩組間臨床妊娠結局的比較

常規組543例患者中有262例進行了新鮮周期移植，TLI組67例患者進行新鮮周期移植的有34例。兩組新鮮移植患者間基本資料、獲卵數、正常受精率、囊胚形成率均無顯著性差異(P>0.05)；兩組間移植日子宮內膜厚度和移植胚胎個數也無顯著性差異(P>0.05)；TLI組的種植率和臨床妊娠率較常規組偏高，但無顯著性差異(P>0.05)(表3)。

表3 兩組中新鮮周期移植患者間臨床結局的比較[(-±s)，%]

三、新鮮周期不同亞組間臨床妊娠結局的比較

根據女方年齡、獲卵數和D3可用胚胎數/移植個數進行的亞組分析顯示，不同年齡段TLI組的種植率和妊娠率較常規培養組均略有提高，但無顯著性差異(P>0.05)；獲卵數≥10和D3可用胚胎數/移植個數>3時，TLI組的種植率和臨床妊娠率較常規培養組有增高趨勢，但無顯著性差異(P>0.05)(表4)。

表4 不同亞組間臨床妊娠結局的比較(%)

討 論

時差成像系統已在IVF-ET中的廣泛應用，觀察系統和培養系統一體化的抽屜式時差成像培養系統具有更穩定的培養環境、數據可追溯性等優點[9]，胚胎動力學在胚胎優選上的應用顯著提升了首次移植種植率和臨床妊娠率[10-11]。有學者提出時差成像培養系統需要在卵母細胞受精早期脫顆粒，為了獲得清晰的圖像信息而過度操作帶來的機械刺激可能損傷胚胎，且頻繁的曝光也可能不利于胚胎發育。通過比較時差成像培養系統和常規培養系統的正常受精數、可用胚胎數、囊胚形成率和卵母細胞利用率，我們發現時差成像培養系統的正常受精數、可用胚胎數、囊胚形成率略有增加，而卵母細胞利用率顯著增高(P<0.05)。TLI回顧胚胎發育全過程，避免了常規培養一過式觀察錯過兩原核出現的時間段，可能與TLI具有較好的胚胎結局相關。常規胚胎培養為了獲得更多的胚胎發育信息，需要多次將胚胎拿出培養箱外觀察，長時間暴露于培養箱外會改變胚胎培養環境的溫度、濕度及氣體含量。雖然時差成像培養系統需要頻繁的曝光胚胎，但光源多采用無害的長波長光，且累計曝光時長遠遠小于常規胚胎培養系統[12]。

目前關于胚胎動力學應用于胚胎選擇以提高胚胎著床率的研究已有報道，大量胚胎發育動力學參數如CC1、CC2、S2、CC3、S3已被證實可以預測胚胎能否種植成功[13]。目前人工智能沒有完全運用于時差成像培養系統，大量的胚胎注釋工作增加了胚胎學家的時間成本，且時差成像培養箱和專用的胚胎皿增加了醫療成本，嚴重限制了時差成像培養系統在臨床的應用。因此我們提出了一種胚胎形態學初篩結合胚胎動力學優選胚胎的簡單方案(詳見方法學中的胚胎優選方案)。通過對比發現TLI組和常規培養組的基礎資料、胚胎結局沒有顯著差異，移植日子宮內膜厚度和移植胚胎數類似，但TLI組的種植率和臨床妊娠率較常規培養組略有增加。為了尋找適合TLI培養的人群，我們對女方年齡、獲卵數、D3可用胚胎數/移植個數進行了亞組分析，我們發現TLI可提升不同年齡段患者的臨床妊娠結局，獲卵數>10個或D3可用胚胎數/移植個數>3時，TLI胚胎優選方案可以連續性記錄胚胎發育的全過程，有效觀察到異常卵裂模式[3-4]、PN轉換、逆卵裂現象[14]；移植前回查原核形成過程，可以避免多精受精胚胎漏檢，排除多核現象[15]，同時結合胚胎動力學篩選胚胎有望顯著提升移植胚胎的種植率和臨床妊娠率。因此，在可供選擇胚胎較多時，TLI胚胎優選方案相對常規形態學胚胎選擇可能具有較大的優勢。

綜上所述，時差成像培養系統具有較高的卵母細胞利用率，TLI胚胎優選方案簡單、操作性強，可望提升胚胎種植率和臨床妊娠率；獲卵數>10個或D3可用胚胎數/移植個數>3個而預計胚胎結局較好時，時差成像培養系統可望提升IVF-ET的臨床妊娠結局。后續我們將擴大數據量繼續觀察TLI系統以及TLI胚胎優選方案的臨床應用價值。