線粒體對卵母細胞發育的影響

安卓，謝聰聰，趙明，王雪瑩，王樹松，尚丹丹*

(1.河北醫科大學研究生院，石家莊 050017；2.河北省計劃生育科學技術研究院，河北省生殖醫院，國家衛生健康委員會計劃生育與優生重點實驗室/河北省生殖醫學重點實驗室，石家莊 050071)

統計數據調查結果顯示，自2012年以來，不孕不育發病率為3%～4%，而我國不孕不育發病率高達12.5%～15%，其中女性因素占一半，不孕不育已經成為全球日益嚴重的問題[1-2]。自世界首例采用IVF-ET技術的試管嬰兒誕生以來，篩選優質的卵母細胞和胚胎并獲得健康的子代一直是IVF的目標，但影響卵母細胞質量、胚胎發育和植入的因素有很多。隨著年齡的增長，女性卵巢儲備功能減退，影響了卵母細胞的質量，因此會出現卵母細胞發育潛能逐漸降低，導致35歲以上女性的生育力顯著下降的現象[3]。如何提高卵母細胞質量一直是不孕領域的研究熱點。

線粒體是影響卵母細胞質量的一個關鍵因素[4-5]。線粒體是細胞內主要的產能細胞器和活性氧(ROS)的來源，可以將葡萄糖轉化成丙酮酸，轉運到卵母細胞中生成三磷酸腺苷(ATP)，參與減數分裂紡錘體的生成及第二次減數分裂中期(MⅡ期)紡錘體結構的維持。在減數分裂中期，卵母細胞內線粒體的動態分布可啟動紡錘體的遷移，這說明線粒體動力學對卵母細胞成熟及下一步發育至關重要[6]。當線粒體出現功能異常、能量儲備不足，會導致卵母細胞減數分裂異常，非整倍體發生率增加[7]。線粒體通過調節鈣離子、環磷酸腺苷(cAMP)和ROS等多種信號因子，影響卵母細胞凋亡。本文主要探究線粒體形態、功能與卵母細胞發育的關系。

一、線粒體與卵母細胞發育

1.線粒體數量、結構、空間分布與卵母細胞發育：線粒體是相互連接、具有高能動性的細胞器，對于維持細胞的正常功能、生長和發育必不可少，在機體出現生理和病理變化時會發生動態改變[8-9]。Liang等[10]和劉珊等[11]研究發現卵母細胞成熟前后線粒體分布不同，成熟卵母細胞中線粒體均勻分布，而未成熟卵母細胞內線粒體分布在核周圍，出現異常的線粒體體積膨大并且呈現均勻的簇狀分布。所以，線粒體的空間分布可以作為卵母細胞發育程度評估的重要指標之一。

在卵母細胞發育過程中，線粒體數量會急劇增加，與初級卵母細胞相比，成熟卵母細胞的線粒體可以從幾十個增加到一百多萬個[12-13]。

在卵母細胞成熟和衰老過程中，線粒體和內質網等各種膜細胞器的結構會發生動態變化，細胞器聚集與生殖細胞的形成和表觀遺傳調控有關[9，14]。2010年，Liu等[15]通過實驗確定了線粒體的3種分布模式：外圍、半外圍和均勻擴散，其中生發泡期(GV期)卵母細胞線粒體大多在外圍分布，在發育成熟的減數分裂時期卵母細胞內，線粒體大多均勻擴散分布，少量的線粒體介于這兩種分布模式之間，呈半外圍分布。隨著年齡的增加，卵母細胞質量下降，線粒體的狀態也隨之發生改變。在卵母細胞GV期，線粒體呈幼稚型，為圓形或橢圓形，少嵴，呈管泡狀嵴，分布在細胞質中；當進行減數分裂時，即在生發泡破裂期，線粒體呈成熟型，長梭形，基質加深，嵴呈板層狀[16]。有研究發現，年輕女性卵母細胞的線粒體多呈圓形，有少量的平行管狀或泡狀嵴和均勻的基質密度，而高齡(≥35歲)女性卵母細胞的線粒體細長且基質內有大量的嵴和較多的高密度顆粒，顆粒細胞中還偶爾可見線粒體腫脹或空泡[17]。

2.線粒體DNA拷貝數及完整性與卵母細胞發育：線粒體由線粒體基因組和核基因組雙重編碼。線粒體DNA(mtDNA)的多拷貝特性可導致異質性，是判斷線粒體功能的重要指標[18]。隨著年齡增長，卵母細胞線粒體自由基活性增強，mtDNA由于缺乏組蛋白和染色質結構的保護而無法自我修復，容易發生突變。所以mtDNA的拷貝數和完整性對卵母細胞質量尤為重要。

隨著卵母細胞發育成熟，線粒體復制增多。到第二次減數分裂中期，1個成熟的卵母細胞內有1萬個線粒體，大約5萬到150萬個mtDNA拷貝數[19]。卵母細胞中mtDNA拷貝數與受精、胚胎發育潛能呈正相關。Bentov等[20]發現mtDNA拷貝數少的卵母細胞發育不良。Chan等[21]研究發現年齡超過35歲的女性卵母細胞中mtDNA 4977片段缺失發生率更高，而且mtDNA拷貝數較低，提示mtDNA拷貝數與供體的年齡呈負相關。Murakoshi等[22]研究發現，與未受精卵母細胞和未卵裂胚胎相比，退化卵母細胞中mtDNA拷貝數顯著降低。Pasquariello等[14]也證明小鼠和女性卵母細胞成熟前后拷貝數有顯著改變，但體內成熟的卵母細胞mtDNA拷貝數高于體外成熟，表明mtDNA的降解是影響卵母細胞成熟的關鍵因素。

老年婦女卵母細胞中的mtDNA常發生一些與年齡相關的突變，其線粒體基因組存在同質A3302G突變，此突變破壞了高度保守的堿基對(2T-71A)并導致mt-tRNA異常，此突變攜帶者的mtDNA拷貝數較低，并可能導致線粒體功能障礙，進而影響卵母細胞質量和后期受精情況[23]。缺失mtDNA 4977片段會對線粒體酶類物質合成造成干擾，出現氧化磷酸化功能異常、能量合成障礙[24]。Keefe等[25]首次在老年女性卵母細胞的mtDNA上發現了5 kb的片段缺失，認為未受精卵母細胞中缺失的mtDNA可作為卵母細胞衰老的標志物。后來 Yesodi等[26]在年輕患者中發現了卵母細胞mtDNA 5286片段突變，這種突變有可能是卵母細胞質量下降的標志。

3.線粒體膜電位與卵母細胞發育：線粒體在產生能量時會將電化學勢能儲存于線粒體內膜，若質子及其他離子濃度的不對稱分布就會在內膜兩側形成線粒體膜電位(MMP)。正常的MMP是線粒體進行氧化磷酸化、產生ATP的必要條件，MMP的穩定有助于維持卵母細胞的正常機能。當MMP下降時，線粒體腫脹、ATP水解、離子穩態遭到破壞，釋放促凋亡因子(如細胞色素C)，促進細胞凋亡[27]。

Van Blerkom等[28]發現，MMP的高低決定了線粒體功能，包括ATP的產生、鈣穩態的調節，并且發現隨著女性年齡的增加，MⅡ卵母細胞中MMP會降低，進而影響胚胎發育。Martínez-Quezada等[29]研究發現在卵母細胞生小泡破裂(GVBD)階段，暴露于全氟己烷磺酸鹽(PFHXS)的卵母細胞MMP顯著降低，說明PFHXS通過降低MMP抑制卵母細胞的成熟。

Liu等[30]的研究結果提示褪黑素可在體外成熟(IVM)期間通過維持人未成熟卵母細胞的MMP、降低Ca2+水平，來減輕人卵母細胞的氧化應激。加了褪黑素的卵母細胞MMP顯著增加，保證了未成熟卵母細胞健康發育[31]。

4.線粒體ATP水平與卵母細胞發育：卵母細胞在發育成熟的過程中需要大量的ATP，主要通過線粒體進行氧化磷酸化(OXPHOS)反應獲得[32]。OXPHOS由電子傳輸鏈(ETC)組成，ETC包括4種多聚酶復合體(復合體Ⅰ指輔酶Q氧化還原酶復合體，復合體Ⅱ指琥珀酸脫氫酶，復合體Ⅲ指細胞色素C氧化還原酶復合體，復合體IV指細胞色素C氧化酶復合體)、兩種移動電子載體(NAD+/NADP+，FAD/FAM)以及ATP合酶(也稱為復合物V，cV)。ETC進行細胞呼吸時會發生氧化還原反應，同時產生cV，是合成ATP的質子原動力[33]。已有研究表明，在卵母細胞和胚胎發育過程中，ATP不足會導致非整倍體增加，導致染色體分離異常[34]。此外，Zhao等[35]發現卵母細胞和胚胎中ATP含量越高，不孕癥患者的妊娠結局越好。

卵母細胞成熟過程中，許多能量底物在線粒體內通過三羧酸循環和氧化磷酸化代謝途徑產生ATP，充足的ATP供給保證了卵母細胞至囊胚期胚胎的發育[36]。Liu等[17]研究發現與高齡組(≥35歲)相比，年輕組(<35歲)卵泡液中顆粒細胞的ATP水平更高，并且ATP5A1作為OXPHOS的4種蛋白質之一，其表達隨年齡增長而降低，說明衰老引起的顆粒細胞功能障礙主要與線粒體OXPHOS復合物表達有關，改善顆粒細胞中的OXPHOS功能可成為解決高齡女性不育癥的突破口。

5.線粒體ROS水平與卵母細胞發育：線粒體既是ROS的生產者，也是ROS的靶標。mtDNA由于沒有組蛋白保護，更容易因產生過量ROS導致自身受損。線粒體是ROS的一個主要來源，ROS會導致mtDNA突變的積累，反過來引起ETC功能失調，從而產生更高效的ROS，形成一個惡性循環，這是線粒體功能障礙、細胞衰老和凋亡的主要原因[37]。線粒體產生ATP的過程中，也會生成一定量的ROS，但少量的ROS會被線粒體中的抗氧化酶清除，以維持氧化還原穩態。當線粒體功能出現障礙時，ROS的產生會增加。過量的ROS可導致氧化應激，對卵母細胞發育成熟過程產生影響，加速卵母細胞的凋亡[38]。電子傳遞系統會持續產生ROS，使得細胞內ROS含量增加，影響線粒體功能，從而降低ATP的合成量，影響減數分裂過程中染色體分離和紡錘體裝配。過量的ROS會導致卵母細胞脆弱性增加，導致紡錘體不穩定、染色體異常、端粒縮短以及衰老的卵母細胞發育能力下降。也有研究表明，高濃度的ROS會上調mtDNA突變率，造成線粒體功能障礙，降低輔助生殖技術成功率[39]。

二、線粒體功能的改善

線粒體對卵母細胞的發育和功能至關重要。通過線粒體移植、線粒體營養劑等方法增強線粒體功能，可以作為輔助治療技術的補充治療，以提高卵母細胞的質量，改善胚胎發育[40]。

線粒體移植是將體外分離得到的供體細胞(目前主要是顆粒細胞、卵母細胞和骨髓間充質干細胞)的線粒體，通過顯微注射注入MⅡ期卵母細胞。異體體細胞線粒體移植是指用外源性體細胞正常的線粒體注射替換不孕女性的卵母細胞線粒體的一種治療方法，即線粒體替代療法[41]。隨著技術發展，卵胞質移植、原核移植、生發泡移植、紡錘體移植、極體移植相繼出現。但外源性線粒體的植入或許會導致后代出現攜帶兩種來源線粒體的情況，因為線粒體具有異質性，所以可能會引起健康隱患[42]。

自體細胞線粒體移植是指用自身其他組織內正常細胞線粒體替換卵母細胞線粒體的一種治療方案[43]。目前自體線粒體移植技術已在臨床上應用。Tzeng等[44]首次通過線粒體移植技術將患者自己卵丘顆粒細胞的線粒體轉移到了卵母細胞中，避免了供體和受體mtDNA的異質性，幫助患者成功妊娠。孔令紅等[45]也發現經自體線粒體移植后，患者胚胎質量改善、妊娠率和種植率均升高。方叢等[46]利用卵母細胞內注射自體骨髓間充質干細胞線粒體技術，為解決原發不孕夫婦胚胎質量差及妊娠結局差等問題提供了新思路。自體線粒體移植會增加卵母細胞的能量并改善后續IVF結果，是治療線粒體異常導致的卵巢儲備功能減退引起不孕或多次胚胎移植失敗患者的有效方法[47]。

綜上所述，線粒體的數量、形態結構、mtDNA拷貝數、線粒體膜電位、產生的ATP和ROS均會影響卵母細胞的發育。隨著研究的不斷深入，線粒體逐漸成為評判卵母細胞質量的重要非侵入性評估手段。但是，線粒體影響卵母細胞發育的功能機制尚不明確。在原有基礎上向前推進線粒體和卵母細胞發育的關系，可以改善女性卵母細胞質量，對改善輔助生殖技術臨床結局和提高臨床妊娠率也具有重要意義。