低劑量60CO-γ射線對斑馬魚胚胎發育及行為的影響

徐 超，李天陽，胡晨劍，郭杭欽，周依鉑，鄒德靚

(1.浙江工業大學 環境學院，浙江 杭州 310014；2.浙江省輻射環境監測站，浙江 杭州 310012)

近年來，核能與核技術利用的快速發展在帶來益處的同時，其放射性污染也越來越受到公眾的關注。2011年日本福島核電站事故導致周邊環境被大量放射性物質污染[1]，并影響水生生物[2]。而在天然環境中，鈾礦區周圍的放射性水平基本處于較高的水平，范圍為76～214 nGy/h[3]，而全球的年均值為59 nGy/h[4]。目前，針對高劑量γ射線輻照的生物學效應已有大量研究報道[5-6]，而針對低劑量電離輻射的生物效應研究是有限的[7]。Garnier-Laplace把0.01 mGy/h(0.24 mGy/d)作為風險評估篩選值，低于該值時，確信暴露不會導致不良影響[8]。γ射線是原子核裂變時釋放出的射線，穿透力強，容易對水生生物造成損傷。有研究表明：γ輻射會對水生生物有遺傳毒性和生殖影響[9]，并且會引起DNA的損傷[10]。比如，γ射線誘導斑馬魚和大西洋鮭魚組蛋白修飾富集位點的基因特異性變化[11]，誘導斑馬魚胚胎發育毒性及細胞凋亡[12]，對胚胎的孵化率和孵化時間也有一定影響[13]。

斑馬魚作為模式生物，具有飼養容易，胚胎透明，胚胎內器官和結構的變化在顯微鏡下易觀察[14]，基因與人類高度相似[15]的優點，并能提供多個毒理學終點以供參考。斑馬魚行為學是一種比較簡單有效的分析神經整合功能的方法，并已形成了許多相關的實驗模型[16]。斑馬魚不僅被廣泛應用于環境化學物的危害識別[17]和風險評估[18-19]，在電離輻射評價領域也有應用[18]。筆者擬采用斑馬魚作為研究對象，以胚胎的存活率、孵化率、畸形率和斑馬魚行為能力為毒理學終點，研究低劑量γ射線輻照對斑馬魚胚胎的發育和行為毒性效應，為低劑量γ射線輻照對水生生物的安全性評價提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 儀 器

ZebraLab行為測試系統(ViewPoint Life Science，法國)，熒光倒置顯微鏡，其他儀器均為實驗室常規儀器。

1.2 斑馬魚飼養和胚胎收集

成年斑馬魚購于中國科學院水生生物研究所。斑馬魚在溫度為28 ℃，光照周期為 14 h光照/10 h黑暗的水循環系統中飼養，并馴化一段時間。斑馬魚的養殖水曝氣24 h以上，并經紫外光殺菌和活性炭過濾(pH值7.2～7.6)。每天喂食兩次豐年蟲，早晚各一次。選擇健康和性成熟的斑馬魚進行產卵，雌雄數量比例1∶2，將魚放入上部裝有漁網的魚缸中，使魚限制在上半部活動，避免吸食魚卵。魚缸上方裝有定時燈，設定時間，次日清晨8點自動打開，斑馬魚受光照刺激產卵。產卵后使用虹吸管吸出魚卵。去除糞便和死卵等雜質后加入適宜濃度的亞甲基藍消毒，最后將胚胎放置在28 ℃的水浴鍋中。

1.3 胚胎輻射

收集斑馬魚胚胎后，設置1 個對照組，4 個輻照組，以兩個6 孔板為容器，每個孔中加入10 mL水溶液并隨機分配15 顆斑馬魚胚胎。采用270 KBqCo-60標準放射源照射(不考慮水溶液對輻照劑量的吸收)，連續照射5 d(24 h不間斷)，5 d后撤去放射源。對照組不作輻照處理。輻照組累積輻射劑量分別為1，2，2.5，15 mGy，每個輻照劑量重復3 個平行。每24 h更換一半水溶液，并定時檢查，及時挑除死卵。

1.4 斑馬魚幼魚發育毒性的測定

于12，24，48，72，96 h用熒光倒置顯微鏡(Ti-S，日本尼康公司)對胚胎進行形態學觀察，記錄死亡率、孵化率和畸形率(包括心胞囊腫、卵黃囊腫、脊柱彎曲)，并及時挑出死卵。

1.5 斑馬魚幼魚行為分析的測定

選取輻照120 hpf(受精后120 h)后的受精胚胎，從每個輻照組中挑選出10 條成活的幼魚，放入96 孔板中(孔板外圍一圈不放魚)，每個輻照組重復3 個平行。每個孔中加入100 μL的去離子水，在28 ℃的環境中適應30 min后放入ZebraLab行為測試系統(ViewPoint Life Science，法國)檢測斑馬魚運動活力。設置光照周期為10 min光照/10 min黑暗，經20 min光照條件的適應之后，開啟行為分析系統檢測，并記錄50 min內幼魚的運動活力隨光暗周期改變的變化規律。

1.6 數據分析

使用Origin 9.1軟件對數據進行作圖，所有結果以平均值±標準偏差的形式表示。使用SPSS 19.0統計軟件對實驗數據進行統計分析，采用單因素方差分析對處理組和對照之間的差異顯著性進行檢驗。其中：*表示P<0.05為顯著性差異；**表示P<0.01為差異極顯著。

2 實驗結果與討論

2.1 幼魚發育毒性

斑馬魚胚胎經低劑量γ射線輻照后，出現的畸形現象包括卵黃囊水腫(YSE)、心胞囊水腫(PE)和脊柱彎曲(CB)，如圖1所示。

CB—身體彎曲；YES—卵黃囊水腫；PE—心包囊水腫。

不同累計劑量γ射線輻照對斑馬魚幼魚死亡率(48 h)、孵化率(72 h)和畸形率(96 h)的結果統計于圖2。由圖2(a)可知：隨著輻照劑量的增加，輻照組死亡率呈現出先下降后上升的趨勢，但均無顯著性差異，P>0.05。與對照組死亡率20%相比，在累積輻照劑量為2 mGy時，死亡率為3.3%，達到最低。由圖2(b)可知：孵化率與死亡率正好相反，隨著輻照劑量的增加，輻照組孵化率呈現出先上升后下降的趨勢，但均無顯著性差異，P>0.05。與對照組孵化率80%相比，在累積輻照劑量為2 mGy時，孵化率為96.7%，達到最高。由圖2(c)可知：與對照組畸形率2.5%相比，輻射組1，2，2.5，15 mGy的畸形率分別為10.0%，10.0%，25.0%，31.4%。其中，累積輻照劑量為2.5 mGy時，輻照組畸形率有顯著性差異，為25.0%，P<0.01。累積輻照劑量為15 mGy時，輻照組畸形率有顯著性差異，為31.4%，P<0.01。其他輻照組畸形率無顯著性差異。

圖2 低劑量γ射線后對幼魚死亡率的影響

雖然斑馬魚胚胎具有孵化率先上升后下降的趨勢和死亡率先下降后上升的趨勢，但沒有顯著性差異，趙維超等[19]用0.01 Gy的γ射線對斑馬魚胚胎輻照后，存活率和孵化率無顯著影響。Selma等[20]發現在低劑量輻照下，孵化率和存活率無顯著性影響，在高劑量輻照下，孵化率和存活率顯著下降。由此可見，低劑量輻照對斑馬魚胚胎的死亡率和孵化率無顯著影響。

相比存活率和孵化率，60Co低劑量γ射線輻照對斑馬魚胚胎畸形率的毒性效應更為顯著。宋經娥[21]用4 Gy的X射線對斑馬魚胚胎輻照后，畸形率顯著增加。趙維超等[19]用0.01 Gyγ射線對斑馬魚胚胎輻照后，畸形率顯著提高。有研究發現：低劑量的γ射線照射可分別通過Hh和PI3K/Akt信號通路誘導斑馬魚胚胎的發育毒性[11]。Kumar等[22]認為DNA損傷與胚胎發育異常之間存在劑量效應關系，DNA單鏈斷裂對斑馬魚胚胎的物理畸形起到誘導作用，并且導致發育基因sox2的下調，這可能共同導致研究中觀察到的所有發育缺陷。

2.2 幼魚行為分析

斑馬魚幼魚經不同低輻射劑量輻照后，在光/暗周期刺激下產生了不同的周期性運動變化。圖3為光照/黑暗周期變化下，低劑量γ射線對斑馬魚幼魚(120 h)運動活力的影響，橫坐標軸上的黑白棒分別代表黑暗與光照。

圖3 低劑量γ射線對斑馬魚幼魚(120 h)運動活力的影響

由圖3(a)可知：不同輻射劑量組的斑馬魚幼魚在光照/黑暗周期環境下的運動游速均表現出黑暗上升光照下降的趨勢，各輻照組之間運動軌跡相同。與對照組相比，輻射組1，2，2.5，15 mGy每分鐘斑馬魚幼魚的運動速度在黑暗條件下均高于對照組，但隨著輻照劑量的增加呈現下降的趨勢。圖3(b)顯示幼魚在不同低劑量輻照下10 min平均游動速度在光暗周期下的變化，也呈現出與圖3(a)相似的趨勢，即相比對照組，輻射組1，2，2.5，15 mGy每10 min斑馬魚幼魚的運動速度在黑暗條件下均高于對照組，但隨著輻照劑量的增加呈現下降的趨勢。由圖3(c)可知：先經過20 min光照適應，50 min檢測時間內，10 min光照/10 min黑暗的光照周期下，在不同低輻射劑量輻照下，幼魚的運動速度在低劑量輻照處理下呈現不同程度的增加。輻射組斑馬魚幼魚的平均自由運動速度都高于對照組。與對照組幼魚(9.54±0.8)mm/min相比，1，2，2.5，15 mGy下斑馬魚每分鐘的平均游速為(12.7±2.1)，(10.3±1.7)，(11.1±4.1)，(10.0±0.8)mm/min，而輻射劑量為1 mGy時游速最高，達到(12.7±2.1)mm/min。有研究發現：低劑量γ輻射輻照造成斑馬魚幼魚體內AChE活性降低，并且對幼魚的肌肉造成影響。這些結果表明：γ輻射可以誘導幼魚神經傳遞的損害，這可能會對運動產生影響[23]。本研究實驗結果表明：1，2，2.5，15 mGy輻照均刺激了斑馬魚幼魚運動，這可能是由于低劑量輻射興奮效應所引起的，適宜的低水平輻射對生物存在有益作用，在鄧曄坤[24]的研究中也發現了低劑量輻射興奮效應。

3 結 論

低劑量γ射線輻照對斑馬魚胚胎有顯著的致畸效應。相比對照組，2.5 mGy和15 mGy輻照對斑馬魚胚胎的畸形率有顯著影響，但對死亡率和孵化率無顯著影響。此外，1，2，2.5，15 mGy輻照均能刺激斑馬魚幼魚運動，斑馬魚幼魚在黑暗條件下的運動速度均高于對照組，但隨著輻照劑量的增加而減少。