釀酒葡萄抗寒性評價及分類

沈甜，牛銳敏，黃小晶，許澤華，陳衛平*

（寧夏農林科學院種質資源研究所，寧夏銀川 750002）

賀蘭山東麓葡萄酒產區已在國內外享有盛名，目前釀酒葡萄面積為3.09萬 hm2，占全國的1/4，因其優越的地理資源和產地優勢，成為我國釀酒葡萄第4個原產地域產品保護區[1]。由于該產區主栽品種多為歐亞種群，其抗寒能力普遍較差，越冬凍害發生頻率高，影響范圍大；加之春季氣溫回升快，晚霜凍結束時間晚，出土較早的園區經常受到晚霜危害；且冬季埋土和春季出土用工量大，種植成本較高[2-3]。因此，開展釀酒葡萄抗寒性研究有助于揭示葡萄越冬凍害形成機理，對促進產業可持續發展具有重要意義。

葡萄抗寒性的鑒定方法及抗寒生理的研究已有諸多報道，張倩等[4-5]對5個葡萄種群18個品種根系的抗寒適應能力和抗寒適應性觀察，通過Logistic方程確定其拐點溫度，為將LT50作為葡萄抗寒種質的篩選指標提供理論和實踐依據。楊豫等[6]以各品種的根系表皮作為測定部位，利用熱電偶溫度傳感器測定了8個釀酒葡萄根系的過冷卻點、結冰點等，揭示供試品種根系的抗寒能力。付曉[7]以45份鮮食葡萄品種一年生休眠枝條為試材，采用差熱分析法得出抗寒性強的品種隨著溫度的降低放熱程度減小，抗寒性弱的品種放熱程度增大。國內外的葡萄抗寒性育種均是利用山葡萄、河岸葡萄、蘡薁葡萄等抗寒性強的品種進行雜交，從山歐、山歐美雜種二代中選育出的‘左紅一’在吉林極端最低氣溫-39.8～-30.6 ℃的情況下，連續7年露地越冬無凍害發生[8]，中國科學院植物研究所利用我國特有的野生葡萄資源山葡萄與歐亞栽培品種雜交獲得的‘北玫’和‘北紅’葡萄根系可耐-11 ℃，枝條可耐-30 ℃的低溫，在寧夏賀蘭山東麓產區不埋土防寒情況下，‘北紅’和‘北玫’的成活率均在90%以上，但其釀制的單品種干紅葡萄酒酸度高，適口性差[9-10]。

細胞質膜是組織細胞對外界低溫環境反應最為敏感的部位，同樣也是植株最初受到凍害的部位。當溫度降低到一定程度時，細胞膜的透性發生改變，細胞膜內大量的可溶性物質滲出，細胞膜內外的離子失衡，導致細胞生理生化和功能發生改變[7]。研究表明，相對電導率、可溶性糖、可溶性蛋白、丙二醛、游離脯氨酸等指標雖不能直接判斷品種間的抗寒性強弱，但都與抗寒性有密切的關系[11-12]。利用高低溫交變試驗箱對釀酒葡萄一年生枝條進行低溫冷凍處理，通過測定生理生化指標，應用聚類分析，對供試品種的抗寒能力進行鑒定和評價，為今后的抗寒性育種資源利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗區概況

試驗地位于銀川市西夏區蘆花臺寧夏農科院枸杞研究所葡萄基地，東經106°8'39''～106°8'44''，北緯38°28'43''～38°38'58''。試驗園地四周空曠，地形平坦，地下水位較淺。土壤屬于灌淤潮土，表層沙壤，土壤肥力較高，pH8.1～8.3。

1.2 試驗材料

供試品種為寧夏農林科學院種質資源研究所葡萄資源圃的15個3年生釀酒葡萄（見表1）。各品種采用直立龍干整形，南北行向，株行距0.5 m×3.0 m，秋季以短梢修剪為主。2018年10月冬季修剪時采集枝條，每個品種選擇充分成熟、粗度均勻一致的一年生健壯枝條20個，沙藏貯存備用。2019年3月取出枝條，用自來水和蒸餾水沖洗干凈。每3～4節剪成一段，石蠟封口。每個品種7份，每份約10段用塑料袋包好，置于冰箱貯藏備用。

表1 供試品種情況Table 1 Introduction about the tested varieties

1.3 試驗處理

用高低溫交變試驗箱（型號：BC1300）對供試枝條進行低溫冷凍處理，設置-15、-18、-21、-24、-27、-30 ℃ 6個低溫處理，以2 ℃貯藏枝條樣本為對照。升降溫度速率均為4 ℃/h，降溫至目的溫度保持24 h后以相同的幅度勻速升溫至2 ℃，取出后在2 ℃冷藏保存進行相關指標的測定。

1.4 試驗相關指標測定及計算

1.4.1 相對電導率測定和半致死溫度計算

將冷凍后的枝條避開芽眼剪成3～4 mm小段，混合均勻，稱取2 g放入25 mL具塞刻度試管中，加20 mL去離子水搖勻，每處理3次重復。在室溫下浸提24 h后，用DDSJ-308F型電導儀測初電導率。封口，于沸水中煮30 min，冷卻至室溫，放置2 h后測定終電導率[13]。

相對電導率（%）＝初電導率/終電導率×100

LT50計算參照Logistic回歸方程：

Y＝K/(1＋ae－bt)

式中：Y為電導率，t為處理溫度，K為Y的最大值。通過直線回歸的方法求出方程參數a、b值，拐點溫度即枝條的半致死溫度（LT50）。

1.4.2 游離脯氨酸含量

將冷凍后的枝條避開芽眼剪成3～4 mm小段，混合均勻，稱取0.5 g剪碎于具塞試管中，加5 mL 3%磺基水楊酸，沸水浴10 min，吸取2 mL提取液加2 mL冰乙酸，再加3 mL酸性茚三酮后沸水浴40 min，冷卻至室溫后加5 mL甲苯充分混勻，避光靜置萃取至少4 h。吸取上層紅色液體在520 nm下測定吸光值，從標準曲線上查得脯氨酸濃度，計算游離脯氨酸含量[14-15]。

1.4.3 丙二醛含量

將冷凍后的枝條避開芽眼剪成3～4 mm小段，混合均勻，稱取0.5 g樣品置于盛有2 mL 10%三氯乙酸溶液的研缽中冰浴研磨至勻漿，用8 mL 10%三氯乙酸溶液分次沖洗轉入離心管中低溫離心（4000 r/min，10 min），吸取2 mL上清液加2 mL 0.6%硫代巴比妥酸溶液，充分混勻后沸水浴15 min，靜置冷卻至室溫分別在450 nm、532 nm、600 nm下測定吸光值，計算丙二醛含量[14-15]。

1.5 數據處理與分析

用Excel 2007進行數據處理和制圖，SPSS 23.0進行單因素方差分析和聚類分析。

2 結果與分析

2.1 低溫對供試品種相對電導率的影響

由表2可知，各品種枝條經不同低溫處理后，相對電導率隨處理溫度的降低呈上升趨勢。在2 ℃下‘西拉’枝條的相對電導率顯著高于其他品種，‘馬瑟蘭’顯著低于其他品種；在-18 ℃時，‘西拉’和‘德引84-5’的相對電導率均顯著高于其他品種，并且急劇上升，其他品種的相對電導率緩慢增加，在47.97%～58.24%；在-21℃時除‘埃蘭菲舍爾’外，其他品種枝條的相對電導率均達到60%以上；在-30～-27 ℃低溫處理下，各供試品種枝條的相對電導率增加已經趨于平緩，基本全部達到90%以上；在-27 ℃時，只有‘紫大夫’的相對電導率低于90%，顯著低于其他品種；-30 ℃時，各品種的相對電導率在92.05%～95.25%。對于供試品種的半致死溫度，-20 ℃以下的有‘霞多麗’‘小芒森’‘艾伯靈’‘赤霞珠’‘埃蘭菲舍爾’‘法國藍’‘黑曼道克’‘小味兒多’和‘馬瑟蘭’9個品種，其中以‘埃蘭菲舍爾’最低，‘西拉’最高。

2.2 低溫對供試品種游離脯氨酸含量的影響

各供試品種枝條中的游離脯氨酸在低溫脅迫下的測定結果如圖1所示，隨著脅迫溫度的降低，供試枝條中游離脯氨酸呈先上升后下降的趨勢。在-15 ℃，‘霞多麗’‘紫大夫’‘威代爾’‘小芒森’‘艾伯靈’‘法國藍’‘瓊瑤漿’和‘黑曼道克’枝條中游離脯氨酸高于對照，其他品種均表現出降低，其中‘埃蘭菲舍爾’和‘馬瑟蘭’在-15 ℃時枝條游離脯氨酸僅有0.02 μg/g。其后，隨著脅迫溫度的降低，各品種枝條中游離脯氨酸變化明顯，‘美樂’‘德引84-5’‘艾伯靈’‘赤霞珠’‘法國藍’‘瓊瑤漿’‘黑曼道克’‘小味兒多’枝條中游離脯氨酸在-21 ℃出現最高值，‘法國藍’最高，比對照增加2.71倍；在-24 ℃的低溫脅迫下，枝條中游離脯氨酸最高的是‘霞多麗’和‘西拉’；在-27 ℃的低溫脅迫下，‘紫大夫’‘威代爾’‘小芒森’‘馬瑟蘭’枝條中的游離脯氨酸較高，其中‘小芒森’最高，‘馬瑟蘭’最低；‘埃蘭菲舍爾’在脅迫低溫-30 ℃時其游離脯氨酸達到最大值，比對照增加15.14倍?？傮w來看，白色葡萄品種在低溫脅迫后枝條中游離脯氨酸普遍低于紅色品種。

2.3 低溫對供試品種丙二醛的影響

由圖2可知，隨著脅迫溫度的降低，供試品種枝條中丙二醛總體呈先下降后升高的趨勢。在2 ℃條件下各品種枝條中丙二醛均為低溫脅迫的最高值，除‘小味兒多’為9.80 μmol/g，其他品種枝條中丙二醛為10.35～15.88 μmol/g，其中‘法國藍’最高。在不同低溫脅迫下，在-21 ℃時出現丙二醛最低值的品種有‘紫大夫’‘西拉’‘德引84-5’‘馬瑟蘭’，丙二醛最高的是‘美樂’；-24 ℃時丙二醛降到最低值的品種有‘艾伯靈’；-27 ℃時‘霞多麗’‘美樂’‘小芒森’‘赤霞珠’和‘馬瑟蘭’的丙二醛為最低，最高為‘美樂’；-30 ℃時出現最低值是‘威代爾’‘埃蘭菲舍爾’‘瓊漿漿’‘黑曼道克’和‘小味兒多’，其中最低的是‘小味兒多’，最高的是‘埃蘭菲舍爾’；在-30 ℃時丙二醛含量出現增加的有‘霞多麗’‘西拉’‘美樂’等8個品種，其中增加值最高的是‘赤霞珠’，其次是‘霞多麗’。白色葡萄品種在低溫脅迫后枝條中游離丙二醛普遍低于紅色品種。

表2 低溫脅迫過程中相對電導率及半致死溫度（LT50）變化Table 2 Changes of low temperature on relative conductivity and their semi-lethal temperature (LT50)

圖1 不同低溫處理游離脯氨酸含量變化Figure1 Changes of free proline contents in shoots after low temperature treatments

2.4 基于供試品種半致死溫度的聚類分析

采用系統聚類組間聯接法，根據半致死溫度對15個葡萄品種進行聚類。由聚類分析譜系圖（圖3）可知，在平方歐氏距離為2.5時，15個釀酒葡萄品種分為5類，第Ⅰ類有‘威代爾’‘瓊瑤漿’‘霞多麗’‘馬瑟蘭’‘小芒森’‘赤霞珠’，這一類釀酒葡萄枝條的半致死溫度在-20.56～-19.89 ℃，第Ⅱ類有‘紫大夫’‘美樂’，這一類釀酒葡萄枝條的半致死溫度在-19.39～-18.99 ℃，第Ⅲ類有‘黑曼道克’‘小味兒多’‘艾伯靈’‘法國藍’，這一類釀酒葡萄枝條的半致死溫度在-21.49～-21.17 ℃；第Ⅳ類有‘西拉’‘德引84-5’，其半致死溫度最高，分別是-17.99～-17.33 ℃，抗寒能力最弱；第Ⅴ類有‘埃蘭菲舍爾’，其枝條的半致死溫度最低，抗寒能力最強，基于半致死溫度的抗寒能力由強到弱依次是：Ⅴ類＞Ⅲ類＞Ⅰ類＞Ⅱ類＞Ⅳ類。在平方歐氏距離為5.0時，15個釀酒葡萄品種被分為3類，第Ⅱ類是‘西拉’和‘德引84-5’，第Ⅲ類是‘埃蘭菲舍爾’，其余的釀酒葡萄品種全部被劃分為Ⅰ類，基于半致死溫度的抗寒能力由強到弱依次是：Ⅲ類＞Ⅰ類＞Ⅱ類。

圖2 不同低溫處理丙二醛含量變化Figure 2 Changes of malondialdehyde contents in shoots after low temperature treatments

圖3 基于半致死溫度的聚類樹形圖Figure 3 Clustering tree based on semi-lethal temperature

圖4 基于全部測定值的聚類樹形圖Figure 4 Clustering tree of 15 wine grape varieties based on all measured value

2.5 基于供試品種指標測定值的聚類分析

采用系統聚類組間聯接法，依據對照和6個低溫脅迫下測定的相對電導率、游離脯氨酸和丙二醛對15個釀酒葡萄進行聚類（圖4），在平方歐氏距離為2.5時，15個釀酒葡萄品種分為10類，第Ⅰ類有‘小芒森’‘瓊瑤漿’‘紫大夫’‘威代爾’‘馬瑟蘭’，第Ⅱ類有‘赤霞珠’，第Ⅲ類有‘埃蘭菲舍爾’，第Ⅳ類有‘美樂’，第Ⅴ類是‘德引84-5’，第Ⅵ類是‘霞多麗’和‘黑曼道克’，第Ⅶ類是‘艾伯靈’，第Ⅷ類是‘小味兒多’，第Ⅸ類是‘法國藍’，第Ⅹ類是‘西拉’。在平方歐氏距離為5.0時，15個釀酒葡萄品種分為7類，第Ⅰ類有‘小芒森’‘瓊瑤漿’‘紫大夫’‘威代爾’‘馬瑟蘭’‘赤霞珠’，第Ⅱ類有‘埃蘭菲舍爾’，第Ⅲ類有‘美樂’‘德引84-5’，第Ⅳ類有‘霞多麗’‘黑曼道克’和‘艾伯靈’，第Ⅴ類是‘小味兒多’，第Ⅵ類是‘法國藍’，第Ⅶ類是‘西拉’?？购芰ψ钊醯摹骼妥顝姷摹Ｌm菲舍爾’均各自為一類。

3 討論與結論

植物在逆境條件下能夠通過調節體內一系列生理生化過程來提高對逆境的抵御能力，并且在一定溫度下，通過誘導植株細胞的代謝活動向著適應低溫、增加抗寒性的方向發展。細胞電解質的外滲程度可用相對電導率來表示，以反映植物細胞膜系統的低溫傷害程度[16-17]；半致死溫度是判斷植物逆境傷害的指標之一[18-19]，尤其在果樹抗寒性上有廣泛應用[20-21]。通過高低溫交變試驗箱對資源圃的15個釀酒葡萄一年生枝條進行不同低溫處理，各品種在不同低溫脅迫下相對電導率差異明顯，抗寒性強的品種，其電導率和相對電導率的上升速率低于抗寒性弱的品種，這與前人研究結果一致，‘西拉’在低溫脅迫下相對電導率顯著高于其他品種，其次是‘德引84-5’，‘埃蘭菲舍爾’的相對電導率最低。

脯氨酸介導植物體內很多細胞和亞細胞的反應，脯氨酸的積累是由于植物體內脯氨酸生物合成激活和脯氨酸降解的抑制共同導致的[22]，并且在逆境解除后被迅速分解利用[23]。而植物體內游離脯氨酸能促進蛋白質的水合作用，蛋白質膠體親水面積增大，能使植物處于低溫時免受傷害。丙二醛是膜脂過氧化作用的最終產物，其累積量是反映植物遭受逆境傷害程度的重要指標[24]。試驗結果顯示，游離脯氨酸和丙二醛呈顯著的負相關，與曹建東[25]研究結果一致。各品種游離脯氨酸及丙二醛在不同脅迫溫度下差異明顯，‘法國藍’的游離脯氨酸在低溫脅迫下明顯高于其他品種，而‘埃蘭菲舍爾’的游離脯氨酸在低溫脅迫下明顯低于其他品種，其游離脯氨酸在-30 ℃時達到最大值；‘馬瑟蘭’的丙二醛在不同低溫處理下明顯低于其他品種，‘法國藍’則明顯高于其他品種。葡萄中脯氨酸在-15 ℃處理后明顯增加，而在-21 ℃后大部分品種的脯氨酸明顯下降。李桂榮等[26]指出，隨著脅迫溫度的逐漸降低，脯氨酸越早出現最大值的其抗寒能力就越弱，但‘艾伯靈’在-18 ℃脯氨酸達到最大值，‘霞多麗’的脯氨酸在-24 ℃時達到最大值，而依據半致死溫度得出‘艾伯靈’的抗寒能力強于‘霞多麗’，因此判定植物抗寒能力強弱應綜合各項指標。

研究結果顯示，葡萄枝條在低溫處理初期丙二醛呈下降趨勢，隨著脅迫深入，丙二醛逐漸升高，說明在進行抗寒鍛煉的初期，生理上有一個適應過程，隨著溫度的持續降低，各品種中丙二醛含量呈升高趨勢，特別是在-15 ℃處理后，增加趨勢更加明顯，這也驗證了前人的研究結果[5]。在對照溫度2 ℃下，各品種枝條中丙二醛含量較高，可能原因是此溫度正是其抗寒鍛煉的臨界值。

依據不同低溫脅迫下相對電導率、游離脯氨酸及丙二醛測定值將15個釀酒葡萄聚為7類（平方歐式距離＝5），第Ⅰ類有‘小芒森’‘瓊瑤漿’‘紫大夫’‘威代爾’‘馬瑟蘭’‘赤霞珠’，第Ⅲ類有‘美樂’和‘德引84-5’，第Ⅳ類有‘霞多麗’‘黑曼道克’和‘艾伯靈’，其他品種各自為一類。而基于半致死溫度將供試品種聚為3類（平方歐式距離＝5），第Ⅱ類是‘西拉’‘德引84-5’，第Ⅲ類是‘埃蘭菲舍爾’，其余的釀酒葡萄品種全部被劃分為Ⅰ類。基于半致死溫度的抗寒能力由強到弱依次是：Ⅲ類＞Ⅰ類＞Ⅱ類。

國內在葡萄形態結構、膜脂成分及蛋白質、抗寒生理生化、種質類型等方面的研究已取得顯著進展[27-30]，但在具體評定葡萄抗寒性時，還應多方面綜合評價，同時結合田間觀察，才能使結果更加準確、科學?？购N工作是一項長期的事業，本文通過聚類分析將不同釀酒葡萄品種分為不同類別，期望為今后抗寒育種研究提供一定的理論支持。