香格里拉海拔高度對‘赤霞珠’葡萄果實花色苷的影響

何濤，杜鴻燕，馬義，鄧維萍，朱書生，杜飛*

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)教育部農(nóng)業(yè)生物多樣性與病害控制重點實驗室，云南昆明 650201）

花色苷由花色素結(jié)合糖苷而成，是一種水溶性色素，廣泛存在于植物液泡中，從而使其呈現(xiàn)不同的顏色[1]。花色苷類物質(zhì)屬于葡萄酒多酚的一種，在葡萄酒中常以花色苷單體、花色苷衍生物及聚合體的形式存在[2]。作為功能性物質(zhì)，花色苷的含量及種類不僅影響葡萄酒的色澤、風(fēng)味、口感，還能與單寧生成復(fù)合物，使葡萄酒中的澀味和粗糙感得以降低，呈現(xiàn)更好的口感，從而影響葡萄酒質(zhì)量，進(jìn)而影響市場價值[3]。葡萄果實中的花色苷主要以糖苷的形式存在，葡萄和葡萄酒中常見的花色苷有15種[4]，其中果實中主要有矢車菊色素、飛燕草色素、芍藥色素、矮牽牛色素和錦葵色素5種花色素誘導(dǎo)體。據(jù)報道，花色苷具有降低肝臟及血清中脂肪含量、抗腫瘤、延血小板凝集等營養(yǎng)和藥理作用，在食品、化妝品、醫(yī)藥等領(lǐng)域都有著巨大的應(yīng)用潛力[5]。花色苷作為黃酮類的一個大分支，能夠清除體內(nèi)的自由基，從而降低氧化酶活性[6]，還具有吸收紫外線、抗氧化等作用，因而選育天然色素豐富、品質(zhì)純良的葡萄品種具有廣闊的前景。

在葡萄生長發(fā)育過程中，花色苷在轉(zhuǎn)色期開始積累，其生物合成途徑和代謝調(diào)控受各種因素的影響，主要有外界環(huán)境因素（溫度、濕度、光照、水分、海拔）；營養(yǎng)條件因素，包括土壤肥力狀況，氮源等；葡萄病蟲害發(fā)生程度；葡萄激素和基因調(diào)控等。研究表明，弱光可降低花色苷的含量，而強(qiáng)光能促進(jìn)花色苷和類黃酮物質(zhì)合成[7]。溫度是影響花色苷合成的重要因素，Spayd等[8]研究表明，較低的平均溫度有利于花色苷的合成，而溫度高于35 ℃會導(dǎo)致花色苷含量降低[9-12]。水分也會影響葡萄花色苷的合成[13]。葡萄栽培模式會改變葡萄環(huán)境條件，從而影響果實花色苷積累；在葡萄轉(zhuǎn)色至成熟期間，花色苷含量還與海拔高度有關(guān)，高海拔地區(qū)溫度低、光照強(qiáng)，有利于花色苷的合成[14-17]。但影響花色苷的因素錯綜復(fù)雜，且各種因素之間有交互作用，因此深入研究各因素及其協(xié)同或抑制作用對花色苷的合成和積累具有重要意義。

目前，國內(nèi)外有關(guān)花色苷的研究主要集中在花色苷資源分布的評價與資源庫的建立、定性與定量方法學(xué)、生理活性與功能、高效提取與綠色分離技術(shù)、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性與分子降解機(jī)制、應(yīng)用與產(chǎn)品開發(fā)等6個方面[18-21]。蔣寶等[22]通過研究海拔對黃土高原地區(qū)‘赤霞珠’果實酚類物質(zhì)含量及抗氧化活性的影響，發(fā)現(xiàn)不同海拔高度能影響‘赤霞珠’果實的品質(zhì)，但影響程度在不同品質(zhì)指標(biāo)間存在差異。在黃土高原地區(qū)，低海拔地區(qū)‘赤霞珠’果實的成熟度、酚類化合物含量及抗氧化能力均優(yōu)于高海拔地區(qū)‘赤霞珠’果實[23]。趙新節(jié)等[24]對花色苷合成的影響因素進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，葡萄品種、氣候條件、土壤條件，以及植物激素和植株負(fù)載等均會影響果實花色苷的合成。而關(guān)于在不同海拔下對葡萄品種‘赤霞珠’果實的花色苷測定的研究較為少見，本研究以香格里拉6個不同海拔的‘赤霞珠’葡萄為試材，對不同成熟期的花色苷含量進(jìn)行測定，以評價香格里拉地區(qū)不同海拔高度對葡萄質(zhì)量的影響，進(jìn)而對推動當(dāng)?shù)仄咸丫飘a(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

材料取自云南省德欽縣6個不同海拔高度的‘赤霞珠’葡萄，分別是日米（1860 m）、尼通（2000 m）、榮中（2100 m）、西當(dāng)（2240 m）、阿東（2600 m）、紅坡（2675 m）。2016年8月19日開始取樣，依據(jù)葡萄生長情況，在其不同生長時期內(nèi)取樣4次，10月15日結(jié)束。6個試驗點分別編號為試驗點1、2、3、4、5、6，將材料置于-80 ℃下保存，備用。

1.2 花色苷的提取

選取大約15粒著色均勻的葡萄，小心剝離果皮，用液氮研磨成粉，稱取1.00 g粉末于50 mL離心管中。然后加入1%的鹽酸-甲醇溶液20 mL，在30 ℃控溫振蕩器中避光提取2 h，期間每30 min換一次水，以防止控溫振蕩器中的水溫過高。提取液于5000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心5 min，收集上清液，然后繼續(xù)用上述方法提取花色苷，重復(fù)提取5次。合并提取液，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸發(fā)干燥（35 ℃，轉(zhuǎn)速60 r/min），殘留物用甲醇溶解，并定容至5 mL容量瓶中，-80 ℃保存待測。每個試驗點做3個重復(fù)。

1.3 香格里拉不同海拔試驗點氣象數(shù)據(jù)檢測方法

試驗采用GPRS-Base系統(tǒng)氣象站采集上述6個不同海拔梯度葡萄園的氣象數(shù)據(jù)。氣象站安置在離葡萄園20 m以內(nèi)的區(qū)域，高度為1.5 m。連續(xù)監(jiān)測大氣環(huán)境中溫度、日照時長、紫外輻射和總輻射、降雨量及相對濕度，數(shù)據(jù)記錄每次1 h。選取2016年8—9月時間段的氣象數(shù)據(jù)，采用SQL（Structured query language）數(shù)據(jù)庫軟件統(tǒng)計平均溫度、平均相對濕度、平均日光輻射強(qiáng)度、總光輻射強(qiáng)度、平均紫外輻射強(qiáng)度、總紫外輻射強(qiáng)度。

1.4 高效液相色譜（HPLC）定性和定量分析

花色素苷的定性分別采用標(biāo)樣矢車菊素葡萄糖苷（Cy）、飛燕草素葡萄糖苷（Dp）、芍藥素葡萄糖苷（Pn）、矮牽牛素葡萄糖苷（Pt）和錦葵素葡萄糖苷（Mv）來進(jìn)行。出峰面積表示5種花色素苷的相對百分含量。液相分析前，待測樣品用0.22 μm有機(jī)微孔濾膜過濾，然后直接進(jìn)樣。

1.5 色譜條件

日本島津（Shimadzu）公司高效液相色譜儀LC-20A，色譜柱采用YMC-TriartC18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。流動相A體積比：水∶甲酸＝90∶10；流動相B體積比：甲酸∶乙腈＝10∶90。洗脫程序：0～1 min，3%B；1～12 min，3%～15% B；12～14 min，15%～25% B；24～28 min，25%～30% B；28～32 min，30%～4% B；32～40 min，4% B；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：525 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

1.6 繪制花色苷單體標(biāo)準(zhǔn)曲線

繪制花色苷單體標(biāo)準(zhǔn)曲線前，先分別將5種花色苷單體標(biāo)準(zhǔn)溶液依次稀釋為不同的濃度梯度。Mv稀釋為：500、250、125、62.5、31.25、15.625 mg/L；Pn、Pt、Cy、Dp稀釋條件為：200、100、50、25、12.5、6.25 mg/L。

1.7 計算方法

Dp：y＝3×106x－5356.5R2＝0.9998094

Cy：y＝3×106x－1573.9R2＝0.9999006

Pt： y＝3×106x－4042.8R2＝0.9997693

Pn：y＝3×106x－993.73R2＝0.9996636

Mv：y＝3×106x－29178R2＝0.995908

其中x為濃度（mg/mL），y為面積，R2表示線性相關(guān)程度。

2 結(jié)果與分析

2.1 ‘赤霞珠’葡萄園氣象因子差異分析

各試驗點在5月—10月期間的溫差均高于26 ℃，平均溫度均超過20 ℃（表1），其中以試驗點2尼通和試驗點4西當(dāng)?shù)臏夭钭畲螅^28 ℃。雖然平均溫度之間沒有顯著差異，但可以明顯看出，隨著海拔的升高，各試驗點平均溫度減低，海拔最高的試驗點6紅坡的平均溫度僅為20.23 ℃。6個試驗點中，除海拔較高的試驗點5及試驗點3外，其平均總輻射強(qiáng)度隨著海拔的增高而升高，試驗點的平均紫外輻射則有不同，在試驗點1、2、3隨海拔增加而升高，在試驗點4、5、6則隨海拔升高而降低。比較特別的是海拔最高的試驗點5、6，二者均位于山谷地帶，其平均相對濕度比其他試驗點高，但紫外輻射卻相對較低。

2.2 ‘赤霞珠’果實花色素苷的組分分析

HPLC法測定結(jié)果表明，香格里拉‘赤霞珠’葡萄果皮中有超過10種花色素苷衍生物，確定花色苷的洗脫順序依次為Dp（16.295 min）、Cy（18.013 min）、Pt（18.958 min）、Pn（19.756 min）、Mv（20.026 min）。

2.3 果實中轉(zhuǎn)色初期不同花色苷組分含量分析

‘赤霞珠’果實轉(zhuǎn)色初期5種主要花色苷組分的測定結(jié)果表明（圖1），試驗點4的Mv含量顯著高于其他試驗點的含量，但是其他4種組分Pn、Pt、Cy、Dp在不同試驗點中的含量沒有顯著差異。

2.4 果實中轉(zhuǎn)色期不同花色苷組分含量分析

圖2結(jié)果表明，在50%轉(zhuǎn)色期時，試驗點2的Dp含量較高，顯著高于試驗點4；Pt在低海拔地區(qū)的含量較高，試驗點1、試驗點2和試驗點3的含量顯著高于試驗點4；低海拔試驗點的Pn含量較高，試驗點2的Pn含量顯著高于試驗點5、6、4；各試驗點Cy差異不大；較低海拔的試驗點2的Mv含量顯著高于試驗點4。

表1 ‘赤霞珠’葡萄園氣象因子統(tǒng)計表Table 1 Statistical table of meteorological factors for 'Cabernet Sauvignon' vineyards

在100%轉(zhuǎn)色期時（圖3），試驗點4的Dp含量上升較快，與試驗點2沒有顯著差異，顯著高于試驗點5；試驗點4‘赤霞珠’果實中的Pt含量大幅上升，顯著高于試驗點1、3、5、6；各試驗點Pn含量均有上升，但試驗點3的上升最少；Cy在較低海拔的試驗點1含量為最高，且顯著高于試驗點3、4、5和試驗點6，以試驗點3的含量最低。Mv變化趨勢為在100%轉(zhuǎn)色期時試驗點4的含量急劇上升，其含量反而顯著高于其他試驗點。

2.5 果實成熟期不同花色苷組分含量分析

圖4結(jié)果表明，試驗點4的Mv含量顯著高于其他試驗點，但是其他4種組分Pn、Pt、Cy和Dp在不同試驗點沒有顯著性差異。

3 討論與結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)在‘赤霞珠’果實中共有10多種花色苷衍生物，其中矢車菊色素、飛燕草色素、芍藥色素、矮牽牛色素和錦葵色素五種為主要花色苷，這與孫磊[25]研究中國野生葡萄果皮花色苷組分得出的結(jié)論類似。歐亞種葡萄主要以單糖花色苷為主，雙糖花色苷含量很少，并且主要以錦葵色素類花色苷為主，唐傳核等[26]研究葡萄多酚類化合物以及生理功能也發(fā)現(xiàn)這5種物質(zhì)為主要花色素。

圖1 果實中轉(zhuǎn)色初期不同花色苷組分Figure 1 Content of different anthocyanin in the early stage of the transition color

圖2 果實中50%轉(zhuǎn)色期不同花色苷組分Figure 2 Content of different anthocyanin in the early stage of 50% transition color

在葡萄轉(zhuǎn)色初期和成熟期，西當(dāng)試驗點‘赤霞珠’果實的Mv含量都顯著高于其他試驗點，而在50%轉(zhuǎn)色期和100%轉(zhuǎn)色期5種花色苷的含量則各有不同。蔣寶等[27]研究認(rèn)為，在黃土高原地區(qū)低海拔處的‘赤霞珠’果實的酚類化合物含量及抗氧化能力均優(yōu)于高海拔坡地‘赤霞珠’果實。趙新節(jié)等[24]研究認(rèn)為，夜間藍(lán)光照射比紅光照射更能促進(jìn)糖分和花色苷的積累，溫度和濕度都會影響花色苷相關(guān)基因的表達(dá)，這與轉(zhuǎn)色初期高海拔葡萄花色苷含量顯著高于低海拔的結(jié)論類似。‘赤霞珠’葡萄果實花色苷的組分及含量跟光照、溫度、濕度、土壤和栽培措施等因素有著密切關(guān)系。有大量證據(jù)表明，花色苷的產(chǎn)生與光和溫度水平呈正相關(guān)，Oliveira等[28]研究表明，與巴西海拔較低的伯南布哥（Pernambuco）相比，海拔較高的巴伊亞（Bahia）地區(qū)葡萄中花色苷單體含量均顯著升高；Mateus等[29]連續(xù)3年在杜羅河谷研究了來自不同海拔的兩種葡萄‘Touriga Nacional’和‘Touriga Francesa’發(fā)現(xiàn)，高海拔會增加葡萄和葡萄酒中花青素的含量。Liang等[30]研究了中國5個葡萄栽培地區(qū)的4個葡萄品種，認(rèn)為高海拔地區(qū)花青素的濃度較高。根據(jù)Winkler等[31]的研究認(rèn)為，葡萄的顏色與溫度有關(guān)，非常冷或非常熱的溫度與較差的顏色呈正相關(guān)。花青素積累的最佳溫度范圍是17～26 ℃。低溫，尤其是在夜間的低溫會增加紅葡萄的色澤，而溫度高于35 ℃，則通常會抑制花色苷的合成。因此，在2000～2600 m海拔區(qū)域的葡萄中發(fā)現(xiàn)的高濃度總單體花色苷可能與生長成熟周期內(nèi)保持在30 ℃以下的最高溫度有關(guān)，有利于花色苷的積累并避免其降解。

圖3 果實中100%轉(zhuǎn)色期不同花色苷組分含量Figure 3 Content of different anthocyanin in the early stage of 100% transition color

圖4 果實中成熟期不同花色苷組分Figure 4 Content of different anthocyanin components in the ripening period