香格里拉海拔高度對‘赤霞珠’葡萄果實花色苷的影響

何濤，杜鴻燕，馬義，鄧維萍，朱書生，杜飛*

（云南農業大學教育部農業生物多樣性與病害控制重點實驗室，云南昆明 650201）

花色苷由花色素結合糖苷而成，是一種水溶性色素，廣泛存在于植物液泡中，從而使其呈現不同的顏色[1]。花色苷類物質屬于葡萄酒多酚的一種，在葡萄酒中常以花色苷單體、花色苷衍生物及聚合體的形式存在[2]。作為功能性物質，花色苷的含量及種類不僅影響葡萄酒的色澤、風味、口感，還能與單寧生成復合物，使葡萄酒中的澀味和粗糙感得以降低，呈現更好的口感，從而影響葡萄酒質量，進而影響市場價值[3]。葡萄果實中的花色苷主要以糖苷的形式存在，葡萄和葡萄酒中常見的花色苷有15種[4]，其中果實中主要有矢車菊色素、飛燕草色素、芍藥色素、矮牽牛色素和錦葵色素5種花色素誘導體。據報道，花色苷具有降低肝臟及血清中脂肪含量、抗腫瘤、延血小板凝集等營養和藥理作用，在食品、化妝品、醫藥等領域都有著巨大的應用潛力[5]。花色苷作為黃酮類的一個大分支，能夠清除體內的自由基，從而降低氧化酶活性[6]，還具有吸收紫外線、抗氧化等作用，因而選育天然色素豐富、品質純良的葡萄品種具有廣闊的前景。

在葡萄生長發育過程中，花色苷在轉色期開始積累，其生物合成途徑和代謝調控受各種因素的影響，主要有外界環境因素（溫度、濕度、光照、水分、海拔）；營養條件因素，包括土壤肥力狀況，氮源等；葡萄病蟲害發生程度；葡萄激素和基因調控等。研究表明，弱光可降低花色苷的含量，而強光能促進花色苷和類黃酮物質合成[7]。溫度是影響花色苷合成的重要因素，Spayd等[8]研究表明，較低的平均溫度有利于花色苷的合成，而溫度高于35 ℃會導致花色苷含量降低[9-12]。水分也會影響葡萄花色苷的合成[13]。葡萄栽培模式會改變葡萄環境條件，從而影響果實花色苷積累；在葡萄轉色至成熟期間，花色苷含量還與海拔高度有關，高海拔地區溫度低、光照強，有利于花色苷的合成[14-17]。但影響花色苷的因素錯綜復雜，且各種因素之間有交互作用，因此深入研究各因素及其協同或抑制作用對花色苷的合成和積累具有重要意義。

目前，國內外有關花色苷的研究主要集中在花色苷資源分布的評價與資源庫的建立、定性與定量方法學、生理活性與功能、高效提取與綠色分離技術、結構穩定性與分子降解機制、應用與產品開發等6個方面[18-21]。蔣寶等[22]通過研究海拔對黃土高原地區‘赤霞珠’果實酚類物質含量及抗氧化活性的影響，發現不同海拔高度能影響‘赤霞珠’果實的品質，但影響程度在不同品質指標間存在差異。在黃土高原地區，低海拔地區‘赤霞珠’果實的成熟度、酚類化合物含量及抗氧化能力均優于高海拔地區‘赤霞珠’果實[23]。趙新節等[24]對花色苷合成的影響因素進行研究發現，葡萄品種、氣候條件、土壤條件，以及植物激素和植株負載等均會影響果實花色苷的合成。而關于在不同海拔下對葡萄品種‘赤霞珠’果實的花色苷測定的研究較為少見，本研究以香格里拉6個不同海拔的‘赤霞珠’葡萄為試材，對不同成熟期的花色苷含量進行測定，以評價香格里拉地區不同海拔高度對葡萄質量的影響，進而對推動當地葡萄酒產業的發展提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

材料取自云南省德欽縣6個不同海拔高度的‘赤霞珠’葡萄，分別是日米（1860 m）、尼通（2000 m）、榮中（2100 m）、西當（2240 m）、阿東（2600 m）、紅坡（2675 m）。2016年8月19日開始取樣，依據葡萄生長情況，在其不同生長時期內取樣4次，10月15日結束。6個試驗點分別編號為試驗點1、2、3、4、5、6，將材料置于-80 ℃下保存，備用。

1.2 花色苷的提取

選取大約15粒著色均勻的葡萄，小心剝離果皮，用液氮研磨成粉，稱取1.00 g粉末于50 mL離心管中。然后加入1%的鹽酸-甲醇溶液20 mL，在30 ℃控溫振蕩器中避光提取2 h，期間每30 min換一次水，以防止控溫振蕩器中的水溫過高。提取液于5000 r/min的轉速下離心5 min，收集上清液，然后繼續用上述方法提取花色苷，重復提取5次。合并提取液，于旋轉蒸發儀上蒸發干燥（35 ℃，轉速60 r/min），殘留物用甲醇溶解，并定容至5 mL容量瓶中，-80 ℃保存待測。每個試驗點做3個重復。

1.3 香格里拉不同海拔試驗點氣象數據檢測方法

試驗采用GPRS-Base系統氣象站采集上述6個不同海拔梯度葡萄園的氣象數據。氣象站安置在離葡萄園20 m以內的區域，高度為1.5 m。連續監測大氣環境中溫度、日照時長、紫外輻射和總輻射、降雨量及相對濕度，數據記錄每次1 h。選取2016年8—9月時間段的氣象數據，采用SQL（Structured query language）數據庫軟件統計平均溫度、平均相對濕度、平均日光輻射強度、總光輻射強度、平均紫外輻射強度、總紫外輻射強度。

1.4 高效液相色譜（HPLC）定性和定量分析

花色素苷的定性分別采用標樣矢車菊素葡萄糖苷（Cy）、飛燕草素葡萄糖苷（Dp）、芍藥素葡萄糖苷（Pn）、矮牽牛素葡萄糖苷（Pt）和錦葵素葡萄糖苷（Mv）來進行。出峰面積表示5種花色素苷的相對百分含量。液相分析前，待測樣品用0.22 μm有機微孔濾膜過濾，然后直接進樣。

1.5 色譜條件

日本島津（Shimadzu）公司高效液相色譜儀LC-20A，色譜柱采用YMC-TriartC18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。流動相A體積比：水∶甲酸＝90∶10；流動相B體積比：甲酸∶乙腈＝10∶90。洗脫程序：0～1 min，3%B；1～12 min，3%～15% B；12～14 min，15%～25% B；24～28 min，25%～30% B；28～32 min，30%～4% B；32～40 min，4% B；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：525 nm；進樣量：10 μL。

1.6 繪制花色苷單體標準曲線

繪制花色苷單體標準曲線前，先分別將5種花色苷單體標準溶液依次稀釋為不同的濃度梯度。Mv稀釋為：500、250、125、62.5、31.25、15.625 mg/L；Pn、Pt、Cy、Dp稀釋條件為：200、100、50、25、12.5、6.25 mg/L。

1.7 計算方法

Dp：y＝3×106x－5356.5R2＝0.9998094

Cy：y＝3×106x－1573.9R2＝0.9999006

Pt： y＝3×106x－4042.8R2＝0.9997693

Pn：y＝3×106x－993.73R2＝0.9996636

Mv：y＝3×106x－29178R2＝0.995908

其中x為濃度（mg/mL），y為面積，R2表示線性相關程度。

2 結果與分析

2.1 ‘赤霞珠’葡萄園氣象因子差異分析

各試驗點在5月—10月期間的溫差均高于26 ℃，平均溫度均超過20 ℃（表1），其中以試驗點2尼通和試驗點4西當的溫差最大，均超過28 ℃。雖然平均溫度之間沒有顯著差異，但可以明顯看出，隨著海拔的升高，各試驗點平均溫度減低，海拔最高的試驗點6紅坡的平均溫度僅為20.23 ℃。6個試驗點中，除海拔較高的試驗點5及試驗點3外，其平均總輻射強度隨著海拔的增高而升高，試驗點的平均紫外輻射則有不同，在試驗點1、2、3隨海拔增加而升高，在試驗點4、5、6則隨海拔升高而降低。比較特別的是海拔最高的試驗點5、6，二者均位于山谷地帶，其平均相對濕度比其他試驗點高，但紫外輻射卻相對較低。

2.2 ‘赤霞珠’果實花色素苷的組分分析

HPLC法測定結果表明，香格里拉‘赤霞珠’葡萄果皮中有超過10種花色素苷衍生物，確定花色苷的洗脫順序依次為Dp（16.295 min）、Cy（18.013 min）、Pt（18.958 min）、Pn（19.756 min）、Mv（20.026 min）。

2.3 果實中轉色初期不同花色苷組分含量分析

‘赤霞珠’果實轉色初期5種主要花色苷組分的測定結果表明（圖1），試驗點4的Mv含量顯著高于其他試驗點的含量，但是其他4種組分Pn、Pt、Cy、Dp在不同試驗點中的含量沒有顯著差異。

2.4 果實中轉色期不同花色苷組分含量分析

圖2結果表明，在50%轉色期時，試驗點2的Dp含量較高，顯著高于試驗點4；Pt在低海拔地區的含量較高，試驗點1、試驗點2和試驗點3的含量顯著高于試驗點4；低海拔試驗點的Pn含量較高，試驗點2的Pn含量顯著高于試驗點5、6、4；各試驗點Cy差異不大；較低海拔的試驗點2的Mv含量顯著高于試驗點4。

表1 ‘赤霞珠’葡萄園氣象因子統計表Table 1 Statistical table of meteorological factors for 'Cabernet Sauvignon' vineyards

在100%轉色期時（圖3），試驗點4的Dp含量上升較快，與試驗點2沒有顯著差異，顯著高于試驗點5；試驗點4‘赤霞珠’果實中的Pt含量大幅上升，顯著高于試驗點1、3、5、6；各試驗點Pn含量均有上升，但試驗點3的上升最少；Cy在較低海拔的試驗點1含量為最高，且顯著高于試驗點3、4、5和試驗點6，以試驗點3的含量最低。Mv變化趨勢為在100%轉色期時試驗點4的含量急劇上升，其含量反而顯著高于其他試驗點。

2.5 果實成熟期不同花色苷組分含量分析

圖4結果表明，試驗點4的Mv含量顯著高于其他試驗點，但是其他4種組分Pn、Pt、Cy和Dp在不同試驗點沒有顯著性差異。

3 討論與結論

研究發現在‘赤霞珠’果實中共有10多種花色苷衍生物，其中矢車菊色素、飛燕草色素、芍藥色素、矮牽牛色素和錦葵色素五種為主要花色苷，這與孫磊[25]研究中國野生葡萄果皮花色苷組分得出的結論類似。歐亞種葡萄主要以單糖花色苷為主，雙糖花色苷含量很少，并且主要以錦葵色素類花色苷為主，唐傳核等[26]研究葡萄多酚類化合物以及生理功能也發現這5種物質為主要花色素。

圖1 果實中轉色初期不同花色苷組分Figure 1 Content of different anthocyanin in the early stage of the transition color

圖2 果實中50%轉色期不同花色苷組分Figure 2 Content of different anthocyanin in the early stage of 50% transition color

在葡萄轉色初期和成熟期，西當試驗點‘赤霞珠’果實的Mv含量都顯著高于其他試驗點，而在50%轉色期和100%轉色期5種花色苷的含量則各有不同。蔣寶等[27]研究認為，在黃土高原地區低海拔處的‘赤霞珠’果實的酚類化合物含量及抗氧化能力均優于高海拔坡地‘赤霞珠’果實。趙新節等[24]研究認為，夜間藍光照射比紅光照射更能促進糖分和花色苷的積累，溫度和濕度都會影響花色苷相關基因的表達，這與轉色初期高海拔葡萄花色苷含量顯著高于低海拔的結論類似。‘赤霞珠’葡萄果實花色苷的組分及含量跟光照、溫度、濕度、土壤和栽培措施等因素有著密切關系。有大量證據表明，花色苷的產生與光和溫度水平呈正相關，Oliveira等[28]研究表明，與巴西海拔較低的伯南布哥（Pernambuco）相比，海拔較高的巴伊亞（Bahia）地區葡萄中花色苷單體含量均顯著升高；Mateus等[29]連續3年在杜羅河谷研究了來自不同海拔的兩種葡萄‘Touriga Nacional’和‘Touriga Francesa’發現，高海拔會增加葡萄和葡萄酒中花青素的含量。Liang等[30]研究了中國5個葡萄栽培地區的4個葡萄品種，認為高海拔地區花青素的濃度較高。根據Winkler等[31]的研究認為，葡萄的顏色與溫度有關，非常冷或非常熱的溫度與較差的顏色呈正相關。花青素積累的最佳溫度范圍是17～26 ℃。低溫，尤其是在夜間的低溫會增加紅葡萄的色澤，而溫度高于35 ℃，則通常會抑制花色苷的合成。因此，在2000～2600 m海拔區域的葡萄中發現的高濃度總單體花色苷可能與生長成熟周期內保持在30 ℃以下的最高溫度有關，有利于花色苷的積累并避免其降解。

圖3 果實中100%轉色期不同花色苷組分含量Figure 3 Content of different anthocyanin in the early stage of 100% transition color

圖4 果實中成熟期不同花色苷組分Figure 4 Content of different anthocyanin components in the ripening period