瑞舒伐他汀通過調控UCP2-SIRT3通路減輕腦缺血/再灌注對神經元線粒體的損傷

董雪佳, 江名芳, 包立道

(內蒙古醫科大學1. 研究生院，內蒙古 呼和浩特 010058，2. 附屬醫院神經內科，內蒙古 呼和浩特 010059，3. 基礎醫學院藥理學教研室，內蒙古 呼和浩特 010110)

RS能提高OGD/R細胞的存活率、抑制細胞凋亡、改變細胞形態、穩定細胞線粒體膜電位；增加OGD/R細胞中UCP2、SIRT3分子和TOMM20蛋白表達，并誘導Drp1和Opa1 mRNA的表達，抑制PGC1 mRNA的表達；沉默UCP2后能明顯降低OGD/R細胞的存活率及TOMM20蛋白的表達，降低Drp1和 Opa1 mRNA的表達，使PGC1 mRNA的表達增加。結論RS通過調控UCP2-SIRT3通路減輕CIR對神經元線粒體的損傷，發揮神經細胞保護作用。

腦卒中是一種常見的臨床疾病，是我國導致死亡和殘疾的主要原因，腦缺血性卒中最為常見，其較高的發病率和致殘率，給人民生活帶來沉重負擔[1]。目前認為唯一有效的治療措施是時間窗內盡快恢復缺血區域腦灌注、挽救缺血半暗帶神經元，但缺血區域血流恢復可能誘發進一步組織損傷和神經功能障礙，這被稱為腦缺血/再灌注(cerebral ischemia/reperfusion injury，CIR)損傷[2]。這是一個涉及細胞毒性、氧化應激損傷、炎癥、凋亡和自噬等多種復雜機制的病理生理過程。眾多研究表明[3-4]，能量缺乏和氧化應激是導致神經細胞缺血/再灌注損傷的主要因素。線粒體作為細胞能量代謝和氧化應激的調節中心，在其中發揮重要作用，因此抑制能量缺乏和氧化應激介導的線粒體損傷對于改善CIR損傷非常重要。解偶聯蛋白2(uncoupling protein 2，UCP2)和去乙酰化酶3(sirtuin-3，SIRT3)作為細胞信號轉導的重要調節因子，影響著細胞在應激條件下的適應和存活。近年來[4-6]，多項研究證明UCP2-SIRT3信號通路通過能量代謝/氧化應激調控CIR損傷。

瑞舒伐他汀(rosuvastatin，RS)在CIR動物模型中通過減輕炎癥損傷[7]、調節血栓形成、改善內皮功能、促進血管生成、減少氧化應激等發揮神經保護作用[8-9]，被廣泛推薦用于缺血性卒中的一級和二級預防治療。近年來很多研究表明，他汀類藥物除影響血脂之外，還具有抑制小膠質細胞過度激活、降低細胞免疫炎癥反應、抑制細胞凋亡壞死、調節線粒體自噬[10]等細胞保護作用，在腦及心肌細胞缺血/再灌注損傷過程中發揮重要作用。Wang等[11]研究證實，RS通過調節UCP2和PPAR-γ表達，保護原代心肌細胞免受OGD/R損傷；Vélez等[12]研究發現，RS能通過負性調節蛋白激酶B-糖原合成酶激酶3β(Akt-GSK-3β)通路，減少線粒體通透性轉換孔開放，保護線粒體，減少OGD/R損傷對心臟細胞的損害；由此我們推測，在CIR損傷中RS同樣具有保護作用，為進一步證實我們的推測，并研究RS在CIR損傷中發揮保護作用的機制，進而開展了本實驗的研究。通過觀察RS對CIR神經元線粒體損傷的影響，探討他汀類藥物神經保護作用及其可能機制，為減輕CIR損傷尋找更多途徑，為缺血性腦卒中臨床治療提供新的實驗依據。

1 材料和方法

1.1 實驗材料和主要試劑

1.1.1實驗材料 人神經母細胞瘤細胞(SH-SY5Y細胞)(AC217)購自于上海澤葉生物科技有限公司。

1.1.2試劑 DMEM培養基(AE2942349)購自于Hyclone；F12k無糖無血清培養基(DZPYG0041)由博士德生物定制；全反式視黃酸(RA)(R2625)和瑞舒伐他汀(RS)(Y0001719)均購自Sigma公司；胎牛血清(100099141)、雙抗(SV30010)、胰酶消化液(T1350-100 mL)購自Gibco公司；山羊血清(SP9001)來自北京中杉金橋生物技術有限公司；UCP2抗體(sc390189)購自美國SANTA；SIRT3抗體(ab40963)和TOMM20抗體(ab56783)均購自Abcam；熒光二抗-抗兔(33106ES60)和熒光二抗-抗鼠(33212ES60)均購自YEASEN；UCP2 siRNA和陰性對照(NC-siRNA)均由上海吉瑪合成提供；細胞凋亡檢測試劑盒(A005-3)和CCK8檢測試劑盒(C008-3)均來自七海復泰生物公司；X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent(X-T)轉染試劑(06366236001)購自ROCHE。

1.1.3儀器 超凈工作臺(浙江蘇凈)；CO2培養箱(Thermo Fisher)；三氣培養箱(松下)；酶標儀(美國BioTek)；倒置顯微鏡(重慶光電)；奧林巴斯熒光顯微鏡；小離心機(1.5 mL)(大龍)；小離心機(1.5 mL)(湘儀)；水平多用脫色搖床(其林貝爾)；超低溫冰箱(海爾)；超微量分光光度計(美國DeNovix)；實時定量PCR儀(英國ITIS)。

1.2 實驗方法

1.2.1細胞培養 將SH-SY5Y細胞接種在含有10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM培養基中，并放置在37 ℃、含5% CO2和飽和濕度的培養箱中培養。每隔1 d對細胞換液1次，每周按照1 ∶3進行傳代1次，收集對數期細胞用于后續研究。

1.2.2細胞轉染 將UCP2-siRNA(UCP2siRNA673；UCP2siRNA853；UCP2siRNA1235)和陰性對照(NC-siRNA)用 Lipofectamine 2000按照轉染試劑3 μL +siRNA 6 μL在SH-SY5Y細胞中進行轉染，4 h后更換正常完全培養基，繼續培養24 h后，采用real-time PCR和Western blot分別檢測UCP2 mRNA和蛋白表達水平，篩選沉默效果最好的UCP2-siRNA用于后續研究。

1.2.3細胞模型建立及分組 將SH-SY5Y細胞用無糖無血清的F12k培養基，在37 ℃、2% O2、5% CO2條件下培養4 h，構建OGD/R細胞模型；根據指定實驗要求，分別給予不同處理，常規培養的SH-SY5Y細胞為control組；造模成功后不給予任何藥物處理的對照組為OGD/R組；RS(40和2.5 μmol·L-1)分別處理OGD/R細胞24 h，分別標記為OGD/R+RSH組和OGD/R+RSL組。篩選出沉默效果最好的UCP2siRNA后，將NC-siRNA和UCP2siRNA用脂質體法轉染OGD/R細胞4 h后，分別予以2.5和40 μmol·L-1RS處理24 h，分別標記為OGD/R+NC組、OGD/R+NC+RSL組、OGD/R+NC+RSH組、OGD/R+UCP2組、OGD/R+UCP2+RSL組和OGD/R+UCP2+RSH組。

1.2.4Real-time PCR檢測UCP2、PGC1、Drp1和Opa1的基因表達 按照“2.2細胞轉染”處理細胞后，用Trizol裂解液提取總RNA并逆轉為cDNA，取cDNA和引物根據反轉錄試劑盒步驟進行擴增。反應條件為： 95 ℃預變性15 min，然后進行40 個循環(95 ℃變性10 s，55 ℃退火20 s，7 ℃延伸20 s)。引物序列(正向和反向)分別為：UCP2：5′-TAG ACGTGGTCAAGACGAGATA-3′和5′-AGGGCATGAA CCCTTTGTAG-3′；β-actin：5′-GCACTCTTCCAGCCT TCCTT-3′和5′- CGTACAGGTCTTTGCGGATG-3′以β-actin為內參照，采用2-△△CT法對UCP2-siRNA表達進行相對定量分析。按照“2.3細胞分組”處理細胞后，用同樣的方法，以GAPDH為內參照定量分析PGC1、Drp1和Opa1的表達，引物序列(正向和反向)分別為：PGC1： 5′-CCAAACCAACAACTTTATC TCTTCC-3′和5′-CACACTTAAGGTGCGTTCAATAGT C-3′；Drp1：5′-CACCCGGAGACCTCTCATTC-3′和5′-CCCCATTCTTCTGCTTCCAC-3′；Opa1：5′-GTGCTGCC CGCCTAGAAA-3′和5′- TGACAGGCACCCGTACTCA GT-3′；GAPDH： 5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′和5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′。

1.2.5Western blot檢測UCP2蛋白的表達 按照“2.2細胞轉染”處理細胞后，將取得的細胞離心加入適量體積的裂解液，冰上裂解1～2 h，4 ℃ 1 500 r·min-1離心10 min，收集上清液。根據說明書，采用BCA法蛋白定量，完成后將蛋白在沸水中變性5 min，冷卻后待使用，將蛋白樣本進行SDS-PAGE凝膠電泳。UCP2蛋白選擇NC膜，采用濕轉法進行轉膜，轉膜時間為75 min。5%脫脂奶粉封閉1 h后，與膜一起放入密閉塑料袋中4 ℃孵育過夜。配制二抗與膜一起在室溫、搖床上孵育2 h，采用化學發光法將試劑1 ∶1進行混合后滴加在膜上，在蛋白凝膠成像系統下進行顯影。

1.2.6CCK8法檢測細胞存活率 參照2.3細胞造模及分組，分別將UCP2沉默前實驗各組(control組、OGD/R組、OGD/R+RSH組和OGD/R+RSL組)及沉默后實驗各組(control組、OGD/R組、OGD/R+RSL組、OGD/R+RSH組、OGD/R+NC組、OGD/R+NC+RSL組、OGD/R+NC+RSH組、OGD/R+UCP2siRNA組、OGD/R+UCP2siRNA+RSL組和OGD/R+UCP2siRNA+RSH組)每孔加入10 μL的CCK8試劑，37 ℃孵育1 h后用酶標儀檢測在450 nm處的吸光值。

1.2.7流式細胞儀檢測細胞凋亡率 將UCP2沉默前實驗各組細胞用400 μL的binding buffer懸浮細胞，分別加入5 μL的Annexin V-Alexa Fluor 488 37 ℃避光孵育15 min后加入10 μL PI 4 ℃避光反應20 min，在1 h內上流式細胞儀檢測。

1.2.8高倍鏡下觀察細胞形態，激光共聚焦法觀察UCP2、SIRT3和TOMM20分子表達和定位 分別將UCP2沉默前后實驗各組采用共聚焦小皿吸棄培養基，PBS清洗5 min×3次，然后用預冷的4%多聚甲醛固定15 min，再次用PBS清洗5 min×3次，觀察細胞形態并拍照。用0.1% Triton-X100(PBS稀釋)破膜10 min，PBS清洗5 min×3次，滴加正常山羊血清后室溫封閉1 h。吸棄血清后進行一抗和二抗孵育，用DAPI(PBS稀釋，稀釋比例1 ∶2 000)染色8 min，PBS清洗5 min×3次，最后滴加足量50%甘油后，進行共聚焦熒光拍照，分別觀察UCP2沉默前實驗各組的UCP2和SIRT3及沉默后實驗各組SIRT3和TOMM20分子表達和定位。

1.2.9JC-1法檢測細胞線粒體膜電位變化 將UCP2沉默后實驗各組吸棄培養基，加入100 μL JC-1染色工作液，充分混勻后置入細胞培養箱37 ℃、5% CO2孵育20 min；在孵育期間，按照每1 mL JC-1染色緩沖液加入4 mL蒸餾水的比例，配制適量的JC-1染色緩沖液，并置于冰浴；孵育結束后，吸棄上清，用JC-1染色緩沖液洗滌2次；加入100 μL細胞培養液，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2 結果

2.1 UCP2沉默細胞系的建立如Fig 1所示：與其它組相比，UCP2siRNA-853組的UCP2在mRNA水平的表達降低，差異具有統計學意義(P<0.05)；如Fig 2所示，與對照組相比，3組UCP2siRNA組的UCP2蛋白表達均降低，差異具有統計學意義(P<0.05)，3組UCP2siRNA組間差異無顯著性，但UCP2siRNA-853組的表達最低，即UCP2siRNA-853沉默效果最好。因此，選擇UCP2siRNA-853序列用于實驗研究。

Fig 1 Effect of different UCP2 series on UCP2 mRNA relative expression on SH-SY5Y

Fig 2 Effect of different UCP2 series on UCP2 protein

2.2 RS對OGD/R細胞的影響

2.2.1RS對OGD/R細胞存活率的影響 如Fig 3所示，與對照組相比，OGD/R組細胞存活率降低，差異具有統計學意義(P<0.05)；與OGD/R組相比，RS組細胞存活率升高，且高劑量RS組作用更明顯，差異均具有統計學意義(P<0.05)；UCP2沉默后，實驗組各組細胞存活率較沉默前各組均明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)。

Fig 3 Effect of different concentrations of rosuvastatin on OGD/R cell survival rate after UCP2

2.2.2RS對OGD/R細胞凋亡的影響 細胞凋亡率/ %=早期凋亡率(B4)+晚期凋亡率(B2)。如Fig 4所示，與對照組(8.7%)相比，OGD/R組細胞凋亡率明顯升高(33.2%)；高劑量RS組細胞凋亡率為11.5%，低劑量RS組為9.6%，二者均明顯低于OGD/R組，差異具有統計學意義(P<0.05)。

Fig 4 Effect of different concentrations of rosuvastatin on OGD/R cell apoptotic rate

2.2.3RS對OGD/R細胞形態的影響 如Fig 5和Fig 6所示，高倍鏡觀察發現：RS組細胞突起延伸和分支明顯多于OGD/R組。UCP2沉默后，轉染組細胞形態較轉染前各組無明顯變化。

2.2.4RS對OGD/R細胞中UCP2、SIRT3和TOMM20分子表達和定位的影響 UCP2、SIRT3和TOMM20均在細胞質中表達；如Fig 7所示，OGD/R組中UCP2和SIRT3免疫熒光最弱，即表達最低，與OGD/R組相比，RS組兩種分子免疫熒光較明顯增強，說明RS能夠增加OGD/R細胞UCP2和SIRT3表達。Fig 8示：UCP2沉默前，RS組TOMM20表達較對照組水平更高，而UCP2沉默后，各組 TOMM20表達均降低。UCP2沉默前后，各組SIRT3表達無明顯差異。

2.2.5RS對OGD/R細胞線粒體膜電位的影響 如Fig 9所示，JC-1在細胞正常情況下以聚集物的形式存在于線粒體基質中而顯示紅色熒光。當膜電位下降時，這些紅色聚集物就會分解成綠色熒光單體。Positive組細胞基本都顯示綠色熒光，與control組相比，OGD/R組綠色熒光增強，紅色熒光基本消失，提示細胞可能進入早期凋亡；RS組紅色熒光明顯增強，提示細胞狀態較好；UCP2沉默后，RS組紅色熒光強度仍然較強，且高劑量組更為明顯，說明RS可以明顯改善OGD/R細胞狀態。

2.2.6RS對OGD/R細胞PGC1、Drp1和Opal表達的影響 如Fig 10所示：與control組相比，OGD/R組細胞中Drp1和Opa1 mRNA表達降低，PGC1mRNA表達增高，差異均具有統計學意義(P<0.05)；RS可以促進OGD/R細胞中Drp1和Opa1 mRNA的表達(P<0.05)降低PGC1mRNA的表達(P<0.05)；UCP2沉默后，RS組Drp1 mRNA表達降低，但低劑量組除外，差異均具有統計學意義(P<0.05)；Opa1 mRNA表達降低(P<0.05)；PGC1mRNA表達增高(P<0.05)。

Fig 5 Effects of different concentrations of rosuvastatin on OGD/R cell morphology(200×)

Fig 6 Effects of different concentrations of rosuvastatin on OGD/R cell morphology after UCP2 silence(200×)

Fig 7 Effects of different concentrations of RS on expression of UCP2 and SIRT3 molecules in OGD/R cells(400×)

3 討論

CIR損傷作為一種復雜的病理生理過程，各種病理機制間相互作用，共同導致了神經細胞的壞死和凋亡，嚴重影響著急性缺血性卒中的治療及預后。近年來，隨著對CIR研究不斷深入，線粒體功能障礙成為CIR損傷的重要機制之一。其中，能量轉換障礙、氧化應激損傷和細胞凋亡作用較大。UCP2和SIRT3作為細胞內重要的能量調節因子，參與線粒體氧化應激反應，在CIR損傷過程中發揮重要作用[13]。研究發現[4,6]，UCP2通過調節線粒體呼吸鏈能量和活性氧的產生，間接影響SIRT 3的活性，SIRT3通過調節下游抗氧化劑PGC 1影響線粒體的生物合成，從而減輕細胞氧化損傷，改善線粒體功能。

RS作為急性缺血性卒中治療的重要藥物，在臨床上發揮越來越重要的作用。RS一直因其強化降脂、穩定斑塊、改善內皮功能、減少炎癥等作用被人們熟知。隨著研究的深入，RS的神經保護作用逐漸被發現，其機制可能與調節線粒體發生和抑制細胞調亡等有關[14-15]。目前國內外研究主要集中在核轉錄因子(NF-κB)介導的信號通路的阻斷[16]、過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(PPAR-γ)的調節、PI3K-Akt-GSK-3β通路和Notch通路激活等方面，對UCP2-SIRT 3信號通路方面的研究較少。本實驗立足于二者之間的相關性設計實驗，通過建立UCP2沉默細胞系，研究RS的神經保護作用機制與UCP2-SIRT 3信號通路之間的關系。實驗發現，CIR損傷會明顯抑制細胞中UCP2和SIRT 3分子的表達，而RS對該抑制作用具有明顯拮抗作用，說明RS能增加OGD/R細胞中UCP2和SIRT3分子的表達；同時還發現，RS能夠明顯提高OGD/R細胞的存活率，抑制OGD/R細胞凋亡，但當UCP2沉默后，各組細胞存活率均明顯降低，說明RS通過調節UCP2分子介導CIR神經元細胞的損傷；RS該作用機制在心臟OGD/R模型中得到廣泛證實[11,17]，本實驗首次驗證RS在腦OGD/R模型中發揮的保護作用及作用機制，具有重要臨床意義。

與我們猜想不同的是，SIRT 3分子的表達在UCP2沉默前后卻未發生明顯變化，通過閱讀文獻，我們發現SIRT 3分子并非直接受控于UCP2分子調節，二者之間的相互作用是通過NAD+水平的變化來實現的，UCP2通過感知能量水平來調節SIRT3活性，維持線粒體穩定狀態，發揮細胞保護作用，RS作用過程中可能存在其他途徑影響細胞能量代謝，從而影響了SIRT3分子表達，我們尚不得而知，RS作用過程中的能量變化機制，需要我們進一步的研究和探索。

Fig 8 Effects of different concentrations of RS on expression of TOMM20 and SIRT3 molecules in OGD/R cells after UCP2 silencing(400×)

Fig 9 Changes of mitochondrial membrane potential in cells after UCP2 silencing under different concentrations of RS

實驗中通過高倍鏡下觀察細胞形態發現，RS可以明顯改變OGD/R細胞形態，促進細胞增殖，這與He等[18]發現的RS能促進原代皮層神經元突起的生長，保護神經細胞免受缺血缺氧損傷的結論相一致；此外RS還可以拮抗OGD/R細胞線粒體膜電位的下降，明顯改善OGD/R細胞狀態，這種作用在UCP2沉默后仍然存在，說明RS通過影響線粒體膜電位而發揮神經細胞保護作用；實驗發現，RS組TOMM20蛋白表達更高，當UCP2沉默后，各組 TOMM20表達都降低，提示RS通過UCP2通路影響線粒體TOMM20蛋白的表達，進而影響線粒體的生物發生。

在線粒體合成相關基因的表達上，實驗發現RS可以誘導OGD/R細胞中Drp1和Opa1 mRNA的表達，拮抗OGD/R損傷引起的PGC1 mRNA的表達增加，當UCP2沉默后，RS的類似作用均消失，充分說明RS通過UCP2途徑介導線粒體相關基因的表達，發揮細胞保護作用。實驗中，在Drp1 mRNA的表達上發現，當UCP2沉默后，低劑量組的RS發揮了明顯的促表達作用，這與預想的實驗結果相矛盾，不能排除有實驗誤差存在可能性，通過閱讀文獻也發現一些類似問題，He等[18]研究發現，用不同濃度RS處理OGD/R損傷細胞，相比于50 μmol·L-1和1 μmol·L-1的RS，5 μmol·L-1的RS對OGD暴露的皮層神經元神經生成有最大的促進作用。這也使我們對實驗結果有了新的思考，RS介導的線粒體合成基因的表達可能受到藥物濃度和劑量影響，也可能存在其它機制的作用，需要我們進一步的實驗和研究。

本實驗觀察到RS通過UCP2-SIRT3途徑提高OGD/R細胞的存活率、增加TOMM20蛋白的表達，影響Drp1、Opal和PGC1 mRNA的表達，從而發揮缺血/再灌注損傷神經細胞的保護作用。目前關于UCP2-SIRT3信號通路在CIR中作用機制尚不完全清楚，對于不同因子之間相互作用，以及與缺血/再灌注時間的關系，還需要進一步研究，同時，對于RS與UCP2-SIRT3信號通路之間具體作用機制及相互影響也將是我們未來研究的方向。RS對線粒體損傷的保護作用被視為其發揮作用的新機制，對于RS發揮神經保護作用的最佳劑量需要我們進一步研究和發現。我們的實驗為RS在急性腦梗死治療中的作用和機制提出了新的方向和思考，也為臨床更加規范有效的使用他汀類藥物提供更多有價值的依據，具有重要的臨床研究和實踐意義。

Fig 10 Relative expression of Drp1, Opa1 and PGC1mRNA in cells after UCP2 silencing under different concentrations of