地骨皮甲素調節VEGF信號通路對分泌性中耳炎大鼠的作用研究

卡迪麗婭·木拉提，艾力根·阿不都熱依木，張 瑾

0 引言

分泌性中耳炎(Otitis media with effusion，OME)是以中耳積液及聽力下降為特征的中耳非化膿性炎性疾病，又稱為滲出性中耳炎或卡他性中耳炎，為耳鼻喉科常見疾病。潑尼松是臨床上治療分泌性中耳炎常用的一種糖皮質激素類藥物，因其不良反應較多而不宜長期使用[1-3]。地骨皮甲素是一種從中藥地骨皮中分離出的生物堿類物質，研究表明，地骨皮具有抗興奮性神經毒性、抗氧化應激、抗炎、抗腫瘤等藥理作用[4-7]。本文通過研究地骨皮甲素對分泌性中耳炎大鼠的作用及機制，為分泌性中耳炎的臨床治療提供新的參考及依據。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠72只，SPF級別，6周齡，體重(180±20)g，購于新疆醫科大學動物實驗中心，購買后進行72 h適應性飼養，自由進食、飲水。地骨皮甲素購買于成都普瑞法科技開發有限公司，卵清蛋白(Ovalbumin，OVA，Ⅴ級)購自美國Sigma公司，VEGF、VEGFR-2和GAPDH抗體均購自Proteintech公司，RIPA蛋白裂解液購自上海碧云天公司，IFN-γ、IL-4、TNF-α、IL-6及IL-1β ELISA檢測試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司，ECL顯色液購自Thermo公司，全自動生化分析儀購自北京島津公司，雙垂直電泳儀、轉印電泳儀、凝膠成像儀均購自伯樂生命醫學產品有限公司。

1.2 分泌性中耳炎大鼠模型的建立及給藥 全部大鼠在電耳鏡下檢查，排除外耳道及中耳感染。將大鼠隨機分為6組，每組12只，分別為對照組、模型組、地骨皮甲素低劑量組、地骨皮甲素中劑量組、地骨皮甲素高劑量組及潑尼松組，除對照組外，其余各組參照文獻方法[8-9]建立分泌性中耳炎大鼠模型。具體方法為：將1.2 mg OVA溶于0.6 ml磷酸緩沖液(Phosphate buffer solution，PBS)，再以5.14 mg氫氧化鋁溶于0.6 ml PBS作為免疫佐劑對大鼠行腹腔注射，第8天重復注射1次，此為全身致敏階段;第15天用10%水合氯醛15 mg/kg對大鼠行腹腔注射麻醉，在手術顯微鏡下經鼓膜以微量進樣器將0.1 mg OVA溶于35 μl PBS后注入大鼠中耳腔，第16天再次麻醉，耳內鏡觀察鼓膜情況，并重復第2次注射，此為耳內激發階段，制成OME模型。耳鏡檢查發現鼓膜明顯內陷、紅斑，部分可見液平面及中耳內氣泡形成，視為造模成功。

造模完成后，根據大鼠體重，對照組及模型組按照20 ml/kg灌胃給予生理鹽水，地骨皮甲素低、中、高劑量組按照20 ml/kg分別灌胃給予大鼠0.5 mg/ml、1 mg/ml、2 mg/ml的地骨皮甲素，潑尼松組按照20 ml/kg灌胃給予大鼠0.25 mg/ml的潑尼松，所有組別每天定時給藥1次，連續給藥21 d，最后一次給藥24 h后，進行后續實驗。

1.3 大鼠血清TNF-α、IL-6及IL-1β水平的測定 對各組大鼠通過眼眶靜脈叢取血至干凈離心管中，于4 ℃靜置4 h，然后置于離心機中，4 ℃，3 500 r/min離心10 min。取上清液，按照ELISA試劑盒說明書檢測大鼠血清TNF-α、IL-6及IL-1β水平。

1.4 大鼠中耳灌洗液中IFN-γ、IL-4水平測定 參照文獻方法[9]，每組取6只大鼠，斷頭處死后，取出聽泡，自聽泡鉆孔，以50 μl PBS灌洗中耳腔3次并收集灌洗液共150 μl，于4 ℃以4 000 r/min離心10 min后，取上清液凍存于-20 ℃備用，按照ELISA試劑盒說明書檢測中耳滲液中IFN-γ、IL-4水平。

1.5 組織樣本的采集及組織蛋白的提取 大鼠頸椎脫臼處死后迅速分離大鼠中耳組織，然后將一部分中耳組織放入10%中性甲醛中固定，其余部分放入玻璃勻漿器中，加入RIPA蛋白裂解液，用玻璃勻漿器勻漿，直至充分裂解，置于4 ℃離心機以12 000 r/min離心10 min，用移液槍將上清液移至另一干凈離心管中，并向其中加入SDS loading buffer，混勻后放入100 ℃水浴5 min，然后放入-20 ℃冰箱儲存備用。

1.6 蘇木精-伊紅染色(Hematoxylin-eosin staining，HE染色) 將在10%中性甲醛中固定24 h后的中耳組織轉移至75%的酒精中，經自動組織脫水機脫水、透明處理，在石蠟包埋機中浸蠟、包埋，進行5 μm切片，水浴展開，撈片，瀝干，放恒溫箱中烘干，置于烘箱中60 ℃烤2 h，常規HE染色，在顯微鏡下進行組織病理學觀察。HE染色步驟：①脫蠟:將石蠟切片依次置于二甲苯(I)5 min→二甲苯(Ⅱ)5 min;②復水：依次置于100%乙醇2 min→95%乙醇1 min→80%乙醇1 min→75%乙醇1 min→蒸餾水洗2 min，各2次,然后把水吸干;③蘇木精染色：置于蘇木精溶液中2 min，自來水流水沖洗2 min，把水吸干;④分化：1%鹽酸乙醇分化30 s，自來水浸泡15 min，吸干水;⑤伊紅染色:置于伊紅溶液中2 min;⑥脫水:依次置于95%乙醇(I)5 min→95%乙醇(Ⅱ)5 min→100%乙醇(I)5 min→100%乙醇(Ⅱ)2 min;⑦封片：置于通風櫥，待乙醇徹底干后依次置于二甲苯(I)5 min→二甲苯(Ⅱ)5 min，待載玻片上殘留二甲苯揮干后用中性樹膠封片。

1.7 Western blot實驗 將凍存的大鼠中耳組織蛋白液于室溫下融化后，采用BCA法測定蛋白濃度，處理好待測樣品后，取50 μg蛋白進行SDS-PAGE電泳分離，轉膜，將分離的蛋白電轉移至PVDF膜上。封閉液室溫封閉1 h，經VEGF、VEGFR-2及GAPDH抗體(1∶1 000)4 ℃孵育過夜。PBST充分洗膜后，加入二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h，PBST清洗后顯色液顯影，利用凝膠成像儀成像后，進行灰度值檢測。

2 結果

2.1 地骨皮甲素對分泌性中耳炎大鼠血清TNF-α、IL-6及IL-1β水平的影響 各組大鼠血清TNF-α、IL-6及IL-1β水平見表1。結果表明，與對照組比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-6及IL-1β水平顯著升高(P<0.05)，提示分泌性中耳炎大鼠存在病理性全身炎癥反應;與模型組比較，地骨皮甲素各劑量組及潑尼松組大鼠血清TNF-α、IL-6及IL-1β水平均顯著降低(P<0.05)，且隨著地骨皮甲素劑量的增加，地骨皮甲素各劑量組TNF-α、IL-6及IL-1β水平逐漸降低。

表1 各組大鼠血清TNF-α、IL-6及IL-1β水平(n=12)

2.2 地骨皮甲素對分泌性中耳炎大鼠中耳灌洗液中IFN-γ、IL-4水平的影響 各組大鼠中耳灌洗液中IFN-γ、IL-4水平見表2。

表2 各組大鼠中耳灌洗液中IFN-γ、IL-4水平(n=6)

結果表明，與對照組比較，模型組大鼠中耳灌洗液中IFN-γ水平顯著降低(P<0.05)，IL-4水平顯著升高(P<0.05)，提示中耳灌洗液IFN-γ、IL-4水平可能與大鼠分泌性中耳炎大鼠發病機制密切相關;與模型組比較，地骨皮甲素各劑量組及潑尼松組大鼠中耳灌洗液中IFN-γ水平顯著升高(P<0.05)、IL-4水平顯著降低(P<0.05)，且隨著地骨皮甲素劑量的增加，地骨皮甲素各劑量組大鼠中耳灌洗液中IFN-γ、IL-4水平變化表現出一定的劑量依賴性。

2.3 病理學檢查 各組大鼠中耳黏膜組織病理學檢查結果見圖1。結果表明，與對照組比較，模型組分泌性中耳炎大鼠中耳黏膜細胞腫脹，黏膜增厚，可見炎癥細胞浸潤及多處細胞脫落，提示造模成功;與模型組比較，地骨皮甲素低、中劑量組分泌性中耳炎大鼠中耳黏膜腫脹情況好轉，少見黏膜細胞脫落，地骨皮甲素高劑量組中耳黏膜較完整，細胞腫脹明顯好轉，偶見黏膜細胞脫落，潑尼松組分泌性中耳炎大鼠黏膜增厚基本消失，偶見細胞腫脹。

圖1 各組大鼠中耳黏膜組織病理學檢查結果(20×)注：A.對照組;B.模型組;C.地骨皮甲素低劑量組;D.地骨皮甲素中劑量組;E.地骨皮甲素高劑量組;F.潑尼松組

2.4 地骨皮甲素對分泌性中耳炎大鼠中耳黏膜VEGF、VEGFR-2水平的影響 各組大鼠中耳黏膜VEGF、VEGFR-2水平見圖2。結果表明，與對照組比較，模型組分泌性中耳炎大鼠中耳黏膜VEGF、VEGFR-2水平顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)，提示VEGF信號通路的過度激活可能與大鼠分泌性中耳炎發病機制密切相關;與模型組比較，地骨皮甲素各劑量組及潑尼松組大鼠中耳黏膜VEGF、VEGFR-2水平均顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)，且隨著地骨皮劑量的增加，VEGF、VEGFR-2水平逐漸降低，即表現出一定的劑量依賴性。

圖2 各組大鼠中耳黏膜VEGF、VEGFR水平(n=6)注：*與對照組比較，P<0.05;#與模型組比較，P<0.05

3 討論

OME的定義為不伴急性中耳炎癥狀和體征的中耳積液。OME具有一定的自限性，但約30%～40%患者會反復發作，其中又有5%～10%的患者發作時間持續≥1年。OME引起的持續中耳積液會降低鼓膜活動度，阻礙聲音傳導。目前臨床上主要采用咽鼓管吹張、鼓膜穿刺、鼓膜置管、腺樣體切除術等對癥治療，使用抗菌藥物、糖皮質激素、黏液促排劑、鼻腔減充血劑等藥物進行病因治療，但這些藥物會引起諸多不良反應，不宜長期應用[1-3]。

地骨皮甲素是一種從地骨皮中分離出的生物堿類物質，具有抗興奮性神經毒性、抗氧化應激、抗炎、抗腫瘤等藥理作用，并能夠抑制NF-κB通路及AP-1的活化，保護大鼠海馬體及預防大鼠因輻射誘發神經炎[4-7]。

VEGF信號通路是參與腫瘤血管生成的重要信號通路。近年來研究表明，VEGF信號通路異常激活與肺癌、乳腺癌、胃癌、膽囊癌、結直腸癌、宮頸癌等多種腫瘤疾病的發生發展密切相關[10-14]。研究表明，分泌性中耳炎大鼠中耳組織中VEGF信號通路表達異常，其發病機制可能與VEGF信號通路異常激活改變了大鼠中耳組織血管通透性有關[15-18]。

本文通過采用注射卵清蛋白的方法建立分泌性中耳炎大鼠模型。結果表明，與模型組比較，地骨皮甲素各劑量組及潑尼松組大鼠血清TNF-α、IL-6及IL-1β水平、中耳灌洗液中IL-4水平均顯著降低，而中耳灌洗液中IFN-γ水平顯著升高，且與地骨皮甲素的劑量呈依賴性;提示地骨皮甲素能夠呈劑量依賴性地顯著降低分泌性中耳炎大鼠血清炎癥因子水平，緩解分泌性中耳炎大鼠中耳炎癥狀態，改善疾病進展，同時可能通過誘導大鼠中耳組織IFN-γ的產生，上調Th1型免疫應答，抑制Th2細胞的增殖，減少Th2炎性介質的釋放，進一步抑制分泌性中耳炎大鼠中耳組織嗜酸性粒細胞的聚集，緩解中耳組織炎癥狀態;病理學檢查結果表明，與模型組比較，地骨皮甲素低、中劑量組分泌性中耳炎大鼠中耳黏膜腫脹情況好轉，少見黏膜細胞脫落，地骨皮甲素高劑量組中耳黏膜較完整，細胞腫脹明顯好轉，偶見黏膜細胞脫落，潑尼松組分泌性中耳炎大鼠黏膜增厚基本消失，偶見細胞腫脹，提示地骨皮甲素能夠明顯改善分泌性中耳炎大鼠中耳黏膜組織病理學改變，緩解分泌性中耳炎大鼠的疾病狀態并改善疾病進展;Western blot結果表明，與模型組比較，地骨皮甲素各劑量組及潑尼松組大鼠中耳黏膜VEGF及VEGFR-2水平均顯著降低，且與地骨皮甲素的劑量呈一定的依賴性，提示地骨皮甲素能夠呈劑量依賴性地降低分泌性中耳炎大鼠中耳黏膜VEGF、VEGFR-2水平，調節大鼠中耳黏膜VEGF信號通路相關蛋白的表達，進而改善分泌性中耳炎大鼠的疾病狀態。

綜上所述，地骨皮甲素能夠緩解分泌性中耳炎大鼠的疾病狀態，改善大鼠疾病轉歸，其作用機制可能與其調節VEGF信號通路有關。