MicroRNA-193a 通過靶向 WT1抑制肝細胞癌發生的機制研究

劉亞琪,鄭承紅

(1.湖北省襄陽市中醫醫院腫瘤科，湖北 襄陽 441000 2.湖北省武漢市中醫醫院,湖北 武漢 430065)

肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是僅次于胃癌和食道惡性腫瘤的第三大惡性腫瘤，男性發生率高于女性，約為 3∶1 。我國 HCC 患者年齡在 45～65 歲之間，但近年來年輕患者的發病率顯著增加[1]。HCC治療方式主要為手術，放射和化療，且預后與臨床和病理類型相關。HCC早期癥狀不明顯，且多數患者由于晚期癌細胞分化率低，治愈率仍然較低[1]。因此，開發生物標志物用于肝癌的早期發現，診斷和治療是當務之急。近年來，研究發現微小RNA(microRNA, miRNA)通過影響靶基因的表達可在癌癥的發展中產生重要調控作用。研究表明miR-193a 在多種人類癌癥中發揮抗癌作用，可以通過調節癌細胞的生長來抑制腫瘤的發展[2]。此外，miR-193a抑制乳腺癌細胞的生長、遷移和侵襲[3]。但是到目前為止，miR-193a在HCC中的具體作用尚不清楚。已發現在卵巢癌中，Wilms'腫瘤1(WT1)具有診斷和預后作用，且WT1的高表達與卵巢癌的侵襲性臨床特征有關[4]。此外，在人乳腺癌中和類膠質瘤中證實WT1的異常表達[5,6]。但是，尚未在HCC中研究miR-193a與WT1之間的相互作用。因此本研究擬探討，MicroRNA-193a通過靶向WT1抑制肝細胞癌的發生及對其機制進行探討。

1 資料與方法

1.1臨床組織標本和患者基本資料:實驗組織取自武漢市中醫醫院的75名HCC接受手術的患者。收集患者年齡、性別、腫瘤分期、是否轉移、分化程度等資料。所有HCC患者在手術前均未接受任何治療，術中收集肝癌組織和癌旁非癌的正常組織，并將它們冷凍在液氮中，然后保存在-80℃的冰箱中進行后續實驗。所有參加本研究的患者均簽署了知情同意書，該研究獲得我院倫理委員會的批準。

1.2細胞培養和miR-193a mimic以及inhibitor轉染:正常人肝細胞系 LO2和肝癌細胞系 MH-CC97H，HCCLM3， Huh7 HCC 細胞系購自中科院上海細胞庫。將細胞系接種在含10%胎牛血清的 Dulbeco改良 eagle’s 培養基中(Gibco，美國)，于37℃，5%CO2的培養箱中進行培養。從RiboBio公司(廣州，中國)獲得miR-193a mimic或inhibitor，以及它們的對照組(NC)。 根據試劑盒說明， 使用Lipofectamine 2000(Invitrogen, 美國)將它們分別轉移到 HCCLM3 細胞中。

1.3實時定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR):根據試劑盒說明，使用TRIzol試劑(Promega，美國)提取肝癌組織總RNA，并使用cDNA合成試劑盒(TIANGEN，中國)合成cDNA。應用SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems，美國)以及ABI 7300 序列檢測系統( Thermo Fisher Scientific，美國)上進行 qRT-PCR。以U6 和GAPDH分別用作 miR-193a 和WT1 的內參對照。使用 2-ΔΔct方法計算CT值。qRT-PCR引物的設計如下：miR-193a,正向：5′-TGGGTCTTTGCGGGCGAGATGA-3′,反向ACCCAGAAACGCCCGCTCTACT-3′；U6,正向：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3',反向：5'-AAC GCTTCACGAATTTGCGT-3'； WT1，正向：5'-CAGGCTGCAATAAGAGATATTTTAAGCT-3'，反向：5'-GAAGTCACACTGGTATGGTTTCTCA-3'；GAPDH， 正向：5'-TGCACCACCAACTGC TTAGC-3'，反向：5'-GGC ATG GAC TGT GGT CAT GAG-3'。

1.4細胞計數(CCK-8)試驗:采用CCK-8試劑盒測定miR-193a mimic 和miR-193a inhibitor轉染后細胞增殖能力的變化。將 3×104HCCLM3 細胞鋪板在96孔板中并孵育0、24、48和72h。然后將細胞放置在帶5%CO2，37℃的保溫箱。取10 μLCCK-8試劑(Dojindo Molecular Technologies，日本)添加到每個孔中處理 2h，使用酶標儀在 450 nm 的吸光度下檢測。

1.5異種移植腫瘤形成試驗:裸鼠(6周)購自南京大學(中國南京)的模型動物研究中心。所有動物實驗均經我院動物護理和使用委員會批準，并根據《實驗動物的護理和使用指南》進行。將帶有miR-193a質粒或陰性對照的4×106HCCLM3細胞將其注射到裸鼠的左上側，每4天觀察一次腫瘤體積。4周后處死小鼠對腫瘤進行稱重。

1.6雙熒光素酶報告基因檢測:將野生的或突變的WT1的3'-UTR插入pmirGLO熒光素酶載體(Promega，美國)，用于熒光素酶報告基因測定。之后，將具有WT1的3'-UTR和miR-193a模擬物的載體轉染到HCCLM3細胞中。最后，使用雙重熒光素酶測定系統(Promega，美國)來檢測熒光素酶活性。

2 結 果

2.1miR-193a在肝癌組織中表達下降:與相鄰的非癌組織相比，HCC組織中的miR-193a表達降低(圖1A)(P<0.01)，且WT1 mRNA在HCC組織中顯著高于正常組織(圖1B)(P<0.01)，進一步相關性分析發現肝癌組織中miR-193a與WT1 mRNA呈顯著負相關(r=-0.454,P<0.001)(圖1C)。此外，miR-193a表達異常與淋巴結轉移(P=0.013)和TNM分期(P=0.004)有關(表1)，提示miR-193a的異常表達可能與肝癌的發生有關。miR-193a和WT1的異常表達還與HCC患者的預后相關，高表達的miR-193a在HCC患者中具有更長的總生存期(P=0.029，圖1D)。

圖1 A.HCC組織和非癌組織miR-193a表達量 B.HCC組織和非癌組織中WT1 mRNA表達量比較 (**P<0.01) C.HCC組織中miR-193a 表達量與WT1 mRNA表達量的相關性 D.miR-193高表達和低表達患者HCC生存曲線分析

表1 miR-193a表達與HCC患者臨床病理特征之間的關系

2.2miR-193a mimic和inhibitor對HCC增殖的影響:我們繼續檢測了 MHCC97H，HCCLM3，Huh7 和 LO2細胞系中 miR-193a的 表達，發現與 LO2細胞相比，MHCC97H，HCCLM3 和 Huh7 細胞系中的 miR-193a 表達下調(圖 2A)。之后，將 miR-193a mimic或inhibitor轉染到HCCLM3 細胞中。結果表明，miR-193a 表達通過其mimic增強， 并通過inhibitor降低(圖2B)。之后我們發現 miR-193a mimic抑制了HCCLM3 細胞的細胞增殖(圖 2C)(*P<0.01)。相反miR-193a inhibitor促進了HCCLM3細胞中的細胞增殖(圖2D)(*P<0.01)。

圖2 A.miR-193a表達量在正常肝細胞系(LO2)以及肝癌細胞系MHCC97H，HCCLM3，Huh7中的表達(**P<0.01 vs LO2 ;*P<0.05 vs LO2) B.miR-193a mimic 和miR-193a inhibitor 對miR-193a 的影響 C.miR-193a mimic對 HCCLM3細胞增殖的影響 (**P<0.01 vs NC) D. miR-193a inhibitor對 HCCLM3細胞增殖的影響(**P<0.01 vs NC)

2.3miR-193過表達抑制了裸鼠成瘤:我們將miR-193a轉染質粒或miR-NC注射到裸鼠中，在第4周發現注射miR-193a質粒的裸鼠中HCC的腫瘤質量顯著小于miR-NC(*P<0.05)(圖3A,B)。

2.4HCC中的miR-193a 直接靶向 WT1:此外，TargetScan (http://www.targetscan.org/) 數據庫表明 miR-193a 具有與 WT1 的 3'-UTR 的結合位點(圖 4A)。在熒光素酶報告基因實驗中發現，miR-193a mimic降低了野生型WT1 的螢光素酶活性。但在具有 mut-WT1 和 miR-193a 模擬物的HC-CLM3 細胞中未觀察到熒光素酶活性的降低(圖 4B)，表明 miR-193a可直接靶向 WT1，并在 HCC 中對其表達起負調控作用。

圖3 A.miR-193a與miR-NC注射成瘤的大體情況B.miR-193a與miR-NC注射致成瘤重量的比較(*P>0.05)

圖4 A. miR-193a 具有與 WT1 的 3'-UTR 的預測結合位點 B. miR-193a模擬物降低了野生型WT1 的螢光素酶活性，但未降低WT1 Mut的活性

3 討 論

研究表明miRNA 在HCC中具有重要的分子功能和病理學意義。目前已經發現許多癌基因和抑癌基因的 miRNA 與 HCC 的腫瘤發生有關。例如，miR-199 通過下調 HCC中 G 蛋白信號傳導 17 的調節因子而起抑制性 miRNA 的作用[7]。相反，miR-219-5p通過調節鈣黏著蛋白1促進了腫瘤的生長和細胞轉移。本研究探討了miR-193a與HCC之間的關系。在HCC中發現miR-193a的下調與淋巴結轉移和TNM分期有關。此外，miR-193a的低表達預示了HCC患者的不良預后。在功能上，miR-193a的過表達在抑制了HCC細胞增殖。

目前已發現miR-193a在人類癌癥中異常表達，并可以作為對抗癌癥的重要武器[2]。例如在肺癌中檢測到miR-193a的下調，還發現miR-193a的下調與非小細胞肺癌的臨床病理特征及預后不良有關[8]。此外，miR-193a通過抑制CCND1表達抑制胰腺癌細胞的增殖和侵襲[9]。此外，miR-193a還被發現是抑制結腸癌發生的關鍵基因[10]。本研究中我們發現miR-193a直接靶向WT1，并在HCC中對其表達起負調控作用。WT1是促紅細胞生成素基因的轉錄激活因子，可影響細胞生長[11]。WT1在某些人類癌癥中的作用不同。此研究中，WT1起到對HCC起到了致癌作用。在HCC中發現了WT1的上調，并預示了肝癌患者的預后不良。此外，發現miR-193a通過靶向WT1抑制乳腺癌的發生[3]。近年來發現WT1被確定為幾個miRNA的直接下游目標。例如，發現miR-15a和miR-16-1通過靶向白血病細胞中的WT1來抑制細胞增殖[12]。miR-590通過調節WT1表達抑制腎母細胞瘤細胞的增殖[12]。

總之，本研究結果表明miR-193a肝癌組織中的表達顯著低于相鄰的非癌正常組織，并與HCC患者的預后不良有關。此外，miR-193a 通過靶向 WT1來抑制 HCC 的腫瘤發生，這將有助于為HCC的診斷和治療提供新的方向。