CDKN3和FOXA1 mRNA在直腸癌中的表達關系及意義

王 凡，劉 偉，李 強，王建勛，張四新

(1.河北省唐山市協和醫院普外科，河北 唐山 0630002.河北省安國市醫院普外科，河北 安國 0712003.解放軍陸軍第82集團軍醫院普外科，河北 保定 071000)

直腸癌是指直腸乙狀結腸交界處至齒狀線之間、原發于直腸黏膜上皮的惡性腫瘤。近年來直腸癌的發病率逐年上升，且其發病有年輕化趨勢。2018年全球范圍內診斷為結直腸癌的患者超過180萬，占所有癌種的10.2%，死亡病例超過86萬，成為全球發病率第三、死亡率第二的惡性腫瘤[1]。近年來直腸癌的早期診斷方法有了提高和進步，但直腸癌早期臨床癥狀如排便習慣、大便性狀的改變相對比較隱匿，容易被患者忽視[2]，因此提高早期檢測甄別技術、確定明確標志物迫在眉睫。細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子3(cyclin-dependent kinase inhibitor 3，CDKN3)為雙重特異性蛋白磷酸酶家族成員，可使CDK1/2去磷酸化并失活[3]，其表達異常與多種惡性腫瘤密切相關[4]，但在直腸癌中如何表達鮮有描述。叉頭框蛋白A1(fork head box protein A1，FOXA1)基因位于人染色體14q21.1站點，參與代謝過程、信號調節、細胞周期相關基因的啟動，與多種腫瘤發病機制相關[5]，但FOXA1在直腸癌發病中的作用尚不明確。因此研究針對CDKN3與FOXA1 mRNA在直腸癌中表達如何這一問題探究其臨床意義，以期兩者可以作為直腸癌檢查的輔助檢查基因。

1 資料與方法

1.1一般資料:選取2017年11月至2020年3月在唐山市協和醫院和解放軍陸軍第82集團軍醫院就診的94例直腸癌患者作為觀察組，男55例，女39例，年齡32～71歲，平均年齡(59.46±6.09)歲。另選取同時期在醫院進行常規體檢的健康人群95例作為對照組，男54例，女41例，年齡38～73歲，平均年齡(60.32±7.81)歲。兩組性別、年齡相比差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究分別經唐山市協和醫院、解放軍陸軍第82集團軍醫院倫理委員會批準。按照《中國結直腸癌診療規范(2017年版)》結直腸癌組織學分級標準[6]，高級別直腸癌：0～49%腺管形成；低級別直腸癌：>95%腺管形成、50～95%腺管形成。其中低級別直腸癌患者36例，高級別直腸癌患者58例。按照美國癌癥聯合委員會(AJCC)/國際抗癌聯盟(UICC)結直腸癌TNM分期系統(第七版)[7]，其中Ⅰ～Ⅱ期45例，Ⅲ～Ⅳ期49例。分化程度：中高分化51例，低分化43例。有淋巴結轉移38例，無淋巴結轉移56例。納入標準：①經MRI常規檢查、病理切片確診為直腸癌患者；②在進行研究前1個月內未服用任何影響消化排泄藥物；③既往無其他惡性腫瘤病史；④臨床資料完整，且取得患者家屬同意和配合，簽署知情同意書。排除標準：①潰瘍性結腸炎、結直腸息肉、直腸腺瘤；②克羅恩病、血吸蟲?。虎酆喜⑸铎o脈血栓、凝血障礙性疾病；④合并其他惡性腫瘤者；⑤合并患有心臟、肝、腎等疾病者；⑥自身免疫疾病患者。

1.2主要試劑與儀器:Trizol試劑盒、逆轉錄試劑盒(北京天漠科技開發有限公司，批號TR205-50、TK223-07)；實時熒光定量PCR試劑盒(杭州主諾生物技術有限公司，批號RT0418-09)；實時熒光定量PCR(qRT-PCR)儀(美國ABI公司，型號7900)。

1.3研究方法

1.3.1樣品采集:所有受試人員空腹>8h，均于清晨采集靜脈血3mL置于促凝試管中，4000r/min離心10min，吸取血清標本置于Eppendrof管中，于-20℃保存。

1.3.2qRT-PCR測定CDKN3與FOXA1 mRNA表達量:從-20℃取出血清樣本，用Trizol試劑提取血清總RNA，異丙醇沉淀濃縮后，用75%酒精洗滌，干燥后加入100μLDEPC水，檢測所得RNA純度及完整度；按照逆轉錄試劑盒說明書將RNA逆轉錄為cDNA，產物置于-20℃保存。qRT-PCR反應(反應體系20μL)：cDNA模板2 μL，10 μL2×SYBR Green PCR Master Mix，上下游引物各1 μL，DEPC水6 μL，每個樣本設置3個平行。根據目的基因設計相應的上下游引物，以GAPDH為內參，引物由寶日醫生物技術(北京)有限公司合成，序列見表1，反應條件：95℃ 30 s；95℃ 10 s、60℃ 90 s，45個循環。使用ΔΔCt法對結果進行相對定量分析，根據各樣本平均Ct值，采用2-ΔΔCt法計算CDKN3與FOXA1 mRNA的相對表達量。見表1。

表1 CDKN3和FOXA1基因RT-PCR引物序列

表2 兩組CDKN3 FOXA1 mRNA水平比較

2 結 果

2.1兩組血清中CDKN3與FOXA1 mRNA表達比較:觀察組血清中CDKN3、FOXA1 mRNA的表達水平明顯高于對照組(P<0.05)。見表2。

2.2高、低級別直腸癌患者血清中CDKN3、FOXA1 mRNA的表達水平比較:高級別直腸癌患者血清中CDKN3、FOXA1 mRNA的表達量明顯高于低級別直腸癌患者(P<0.05)。見表3。

2.3CDKN3、FOXA1 mRNA與直腸癌臨床病理特征的關系:將觀察組血清CDKN3、FOXA1 mRNA的表達以其中位值分為兩組，高于中位值者為高表達組，低于中位值者為低表達組。直腸癌患者血清中CDKN3、FOXA1 mRNA的表達水平與性別、年齡均無明顯關系(P>0.05)，與TNM分期、分化程度和淋巴結是否轉移有關(P<0.05)。見表4。

表3 高低級別直腸癌患者血清中CDKN3與FOXA1mRNA的表達

表4 直腸癌患者血清中CDKN3 FOXA1 mRNA表達與臨床病理特征的關系n(%)

2.4血清中CDKN3、FOXA1 mRNA對高、低級別直腸癌患者的診斷價值:以血清中CDKN3、FOXA1 mRNA水平為檢測變量繪制ROC曲線，CDKN3 mRNA診斷高、低級別直腸癌的ROC曲線下面積為0.839(95%CI：0.759～0.919)，截斷值為5.317，靈敏度為63.8%，特異性為94.4%；FOXA1 mRNA診斷高、低級別直腸癌的ROC曲線下面積為0.853(95%CI：0.777～0.929)，截斷值為0.740，靈敏度為70.7%，特異性為97.2%。詳見圖1。

圖1 血清中CDKN3、FOXA1 mRNA對高、低級別直腸癌患者的診斷價值

3 討 論

近年來，我國直腸癌的發病率和死亡率均保持上升趨勢，隨著城市化進程的加速，城市地區較農村地區高發，又多因部位隱秘，患者常忽視其危險性，發現時已屬于中晚期。早期直腸癌可無明顯癥狀，但病情發展到一定程度可出現糞便性狀及排便習慣改變、腹痛或腹部不適、腹部腫塊、腸梗阻、貧血及全身出現消瘦、乏力、低熱等癥狀[8]。盡管最近在治療直腸癌的新型腫瘤藥物方面取得了令人矚目的進展，有學者認為如果直腸癌患者不進行外科手術切除，幾乎不能實現治愈[9]。因此能夠及早檢測出直腸癌危險標志物，對于直腸癌診治具有重要意義。

CDKN3是一種雙重特異性蛋白磷酸酶，可使細胞周期蛋白依賴性激酶去磷酸化，因此作為一種細胞周期進程的關鍵負調控因子，其失調或突變與多種癌癥有關[10,11]。如CDKN3呈高表達用于診斷宮頸癌的敏感性及特異性可分別達到93%、96%，對癌前診斷具有重要價值[12]。Chang等[13]通過研究發現，CDKN3高表達與鼻咽癌病情進展有關，可用于評估危險分層的輔助手段，也可能成為潛在治療靶點。FOXA1是FOX家族中的一員，FoxA家族與惡性腫瘤的發生發展關系是近來研究的熱點，作為轉錄因子與惡性腫瘤的發生、增殖、浸潤及轉移密切相關，在早期器官形成、機體代謝及穩態維持中具有重要作用[14]。有學者[15]經研究表明FOXA1表達可以被看成為一種腫瘤低侵襲的特征，說明FOXA1有可能成為預后的良好標志物。本研究結果顯示直腸癌患者血清中CDKN3、FOXA1 mRNA表達水平明顯高于對照組，推測CDKN3、FOXA1可能參與直腸癌發生、發展的過程。高級別直腸癌患者血清中CDKN3、FOXA1 mRNA的表達量明顯高于低級別直腸癌患者，表明CDKN3、FOXA1可能促進癌細胞分化與增殖，可能用于預測直腸癌病情進展。

本研究另行二者與臨床病理特征的對比，發現直腸癌患者血清中CDKN3、FOXA1 mRNA表達水平與TNM分期、分化程度和淋巴結是否轉移有關，驗證了二者參與直腸癌病情的發展。以血清中CDKN3、FOXA1 mRNA水平為檢測變量繪制ROC曲線診斷高、低級別直腸癌的曲線下面積分別為0.839、0.853，截斷值分別為5.317、0.740，靈敏度及特異性均較高，因此本研究認為CDKN3、FOXA1 mRNA對高、低級別直腸癌診斷具有一定價值，而且為進一步提高對患者的診斷準確度，臨床可考慮將兩者聯合分析以提高效能。

綜上所述，直腸癌患者血清中CDKN3、FOXA1 mRNA表達量上升，且高級別直腸癌患者二者表達量顯著高于低級別直腸癌患者，CDKN3、FOXA1 mRNA參與直腸癌病情發展，對高、低級別直腸癌診斷具有一定價值。但本研究也具有一定缺陷性，如樣本數過少，后期應過大樣本量或擴大地域進行分析，深入探究兩者在直腸癌中的作用機制，以求得到更準確的研究結果。