早期運(yùn)動(dòng)聯(lián)合戊四氮對(duì)腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能的效果及其機(jī)制

彭志鋒，張義平，張繼紅

山西大同大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理系教研室，山西大同市037009

腦卒中是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致身體殘疾的主要原因之一，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素在神經(jīng)可塑性、神經(jīng)發(fā)生和神經(jīng)保護(hù)中起重要作用[1]。腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素家族的一員，在腦卒中后運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)中起重要作用[2-3]。有氧運(yùn)動(dòng)可增加動(dòng)物模型大腦皮質(zhì)、紋狀體和海馬等腦區(qū)BDNF 表達(dá)[4-5]。另外，腦卒中也影響γ-氨基丁酸(gama-aminobutyric acid,GABA)介導(dǎo)的抑制功能。腦卒中小鼠半影區(qū)神經(jīng)元GABA 介導(dǎo)的肌張力抑制增強(qiáng)，注射GABA 受體拮抗劑可改善腦卒中小鼠的感覺(jué)運(yùn)動(dòng)功能[6]。本研究探討早期跑步運(yùn)動(dòng)和GABA 受體拮抗劑戊四氮(pentetrazol,PTZ)對(duì)缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能和BDNF表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

雄性Sprague-Dawley 大鼠50 只，體質(zhì)量240～280 g，購(gòu)于山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(晉)2009-0001。研究過(guò)程中對(duì)動(dòng)物處理均按照國(guó)家頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》和山西大同大學(xué)醫(yī)學(xué)研究倫理委員會(huì)要求執(zhí)行。大鼠平均分為假手術(shù)組、模型組、運(yùn)動(dòng)組、戊四氮組和綜合組，每組10只。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

ZH-PT 型電動(dòng)跑步機(jī)：安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司。戊四氮、TTC 染料：美國(guó)SIGMA 公司。RNA 提取試劑盒、BDNF ELISA 試劑盒：天根生物科技有限公司。基因特異性引物由上海斯信生物科技有限公司合成。

1.3 模型制備

除假手術(shù)組外的大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉60 mg/kg 麻醉。剪毛后頸正中切口，分離出頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，線栓法行大腦中動(dòng)脈阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)。MCAO 后1 h拔出線栓，縫合皮膚。

假手術(shù)組同法手術(shù)，但不插入線栓。

1.4 干預(yù)方法

術(shù)前，運(yùn)動(dòng)組和綜合組跑步機(jī)上適應(yīng)性訓(xùn)練3 d，每天10 min。術(shù)后2 d，運(yùn)動(dòng)組和綜合組跑步機(jī)上訓(xùn)練，速度15 m/min，每天30 min，共5 d；術(shù)后2 d，戊四氮組和綜合組每天腹腔注射戊四氮0.25 mg/kg，共5 d。

1.5 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)價(jià)

術(shù)后7 d，采用5分制神經(jīng)分級(jí)評(píng)估神經(jīng)缺損。0，無(wú)明顯神經(jīng)缺損；1，右側(cè)前肢彎曲；2，當(dāng)尾巴被牽拉時(shí)，右前肢肌力下降；3，當(dāng)尾巴被牽拉時(shí)，向右轉(zhuǎn)圈；4，自發(fā)向右轉(zhuǎn)圈[7]。

1.6 TTC染色

行為學(xué)評(píng)分后，各組取5 只大鼠，迅速斷頭取腦，-20 ℃冰箱冷凍約15 min，冠狀切片，厚1.5 mm。腦片迅速放入1% TTC 磷酸鹽緩沖液中，37 ℃水浴避光孵育10 min。計(jì)算腦梗死體積[8]。

1.7 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)

各組取5 只大鼠，心臟灌注處死。取大腦缺血半影區(qū)部分組織，RNA 提取試劑盒提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA。BDNF 特異性引物行RTPCR 擴(kuò)增。產(chǎn)物電泳，凝膠圖像分析系統(tǒng)分析，以假手術(shù)組為基礎(chǔ)計(jì)算相對(duì)光密度。

引物序列：上游5'-ATC CAC TGA GCA AAG CCG AAC-3'；下游5'-CAG CCC ATG CAA CCG AAG TA-3'。

1.8 ELISA

大腦缺血半影區(qū)部分組織勻漿，離心取上清，按照BDNF ELISA 試劑盒的步驟操作，492 nm 處測(cè)光密度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以假手術(shù)組為基礎(chǔ)計(jì)算BDNF 相對(duì)濃度。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，以(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Tukeyt檢驗(yàn)。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分

術(shù)后7 d，假手術(shù)組神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分正常，模型組評(píng)分增高(P<0.05)；與模型組相比，運(yùn)動(dòng)組評(píng)分降低(P< 0.05)，綜合組評(píng)分進(jìn)一步降低(P< 0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分比較

2.2 腦梗死體積

假手術(shù)組無(wú)梗死，模型組有明顯局灶性梗死(P<0.05)；與模型組相比，運(yùn)動(dòng)組和戊四氮組腦梗死體積均降低(P<0.05)，綜合組腦梗死體積進(jìn)一步降低(P<0.05)。見(jiàn)圖1、表2。

2.3 BDNF mRNA及蛋白表達(dá)

圖1 各組典型TTC染色

與假手術(shù)組相比，模型組BDNF mRNA 和蛋白表達(dá)均降低(P<0.05)；與模型組相比，運(yùn)動(dòng)組和戊四氮組BDNF 表達(dá)增高(P<0.05)，綜合組BDNF 表達(dá)進(jìn)一步升高(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組檢測(cè)指標(biāo)比較

3 討論

以GABA 為靶點(diǎn)的運(yùn)動(dòng)或藥物治療對(duì)腦卒中運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)有益[9]。BDNF 能增強(qiáng)突觸可塑性，如長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)，可能是腦卒中后恢復(fù)的潛在生物標(biāo)志物[10-11]。腦卒中后學(xué)習(xí)記憶改善不僅伴有海馬BDNF 上調(diào)，也伴隨膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子上調(diào)[12-13]。GABA 受體拮抗劑可增加BDNF 表達(dá)[14]。有氧運(yùn)動(dòng)可增加動(dòng)物模型腦區(qū)BDNF 表達(dá)[15-17]。本研究顯示，聯(lián)合采用跑步運(yùn)動(dòng)與低劑量戊四氮，比單獨(dú)干預(yù)更能促進(jìn)腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)，可能與上調(diào)大鼠缺血半影區(qū)BDNF表達(dá)水平有關(guān)。

Ca2+是眾多細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)鍵調(diào)控因子[18]。Ca2+流入神經(jīng)元觸發(fā)環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMPresponse element binding protein,CREB)磷酸化，而CREB 是BDNF 轉(zhuǎn)錄激活的最重要調(diào)節(jié)因子之一[19]。戊四氮阻斷GABA 活性，并伴隨著Ca2+流入和CREB磷酸化[20]。運(yùn)動(dòng)可激活皮質(zhì)神經(jīng)元，增強(qiáng)CREB 磷酸化[21]。

本研究選擇低劑量GABA 受體拮抗劑，以避免可能的副作用，如神經(jīng)毒性。本研究和以往研究中均未發(fā)現(xiàn)低劑量GABA 受體拮抗劑有明顯副作用，提示短期小劑量GABA 受體拮抗劑給藥的安全性[22]。以GABA 介導(dǎo)的突觸抑制為靶點(diǎn)，可為神經(jīng)藥理學(xué)和運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)神經(jīng)可塑性提供新的理論依據(jù)。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。