補陽還五湯對自噬相關蛋白LAMP2 的影響

陳云歡 吳旋 林幸清 汪欣

補陽還五湯，出自清代王清任《醫林改錯·卷下·癱痿論》，由生黃芪、當歸尾、赤芍、川芎、桃仁、紅花、地龍七味中藥組成。本方重用黃芪，大補脾胃之元氣，使氣旺血行，祛瘀通絡，并配伍歸尾活血養血，使化瘀而不傷血；佐以川芎、赤芍、桃仁、紅花活血祛瘀，地龍通絡；諸藥合用，從而達到氣旺則血行，活血而又不傷正[1]。本方在臨床上廣泛用于治療腦缺血患者。腦缺血在中醫學上屬于中風病范疇，氣虛血瘀是本病的主要證型，治療多以益氣活血為主[2]。近年研究表明，補陽還五湯能夠從多靶點、多通路改善大腦缺血再灌注損傷，提高新生神經元數量，促進神經損傷修復[3-5]。為了探索補陽還五湯對腦缺血后神經功能修復的作用靶點及防治機理，本實驗通過構建大鼠腦缺血-再灌注模型，分別采用不同劑量的補陽還五湯進行干預，通過分析自噬-溶酶體信號通路LAMP 蛋白表達變化探討補陽還五湯的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

健康清潔級雄性成年Wistar 大鼠50 只，體質量約100 ～150g，購自福建中醫藥大學動物實驗中心。隨機分成假手術組（145.99±0.81）g、模型組（146.77±0.97）g、補陽還五湯常規劑量組（146.46±1.13）g、補陽還五湯2 倍劑量組（146.35±1.03）g、補陽還五湯10 倍劑量組（147.01±1.12）g，每組10 只。

1.2 主要試劑和儀器

補陽還五湯（購自北京康仁堂藥業有限公司），Western 一抗稀釋液、Western 二抗稀釋液、β-Actin 抗體、Western 轉膜液、Western 封閉液、SDS-PAGE 電泳液（碧云天生物科技公司），LAMP2 兔多克隆抗體、二抗HRP 標記的羊抗兔IgG 抗體（美國PTG 公司），Western blot 電泳設備（Bio-rad 公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 大鼠腦缺血模型構建 取清潔大鼠，術前禁食12 h，麻醉后，固定頭部及四肢，暴露頸部，切開皮膚鈍性分離至暴露頸動脈，采用改良線栓法制備大鼠大腦中動脈栓塞模型。

1.3.2 補陽還五湯灌胃 50 只大鼠隨機分成五組，每組10 只。假手術組：大鼠正常飼養，不進行任何干預；模型組：大鼠造模后不進行任何藥物干預；常規劑量組：2.5 g/（kg·只）；2 倍劑量組：5 g/（kg·只）；10 倍劑量組：25 g/（kg·只）。三組大鼠均每天灌胃1 次，造模前灌胃7 天，造模后繼續灌胃7 天。

1.3.3 LAMP2 蛋白表達水平 每組隨機取5 只大鼠斷頭取腦，取皮質部分打勻漿，加入裂解液提取細胞總蛋白，置于4℃，SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白，轉移到PVDF 膜，室溫封閉2小時。加入一抗，4℃孵育過夜。加入相應二抗，室溫孵育2 小時，棄二抗稀釋液，洗滌。凝膠成像系統進行顯影和目標條帶的灰度值分析。

1.4 統計學方法

采用SPSS 19.0 軟件對數據進行統計學分析。計量資料數據以（±s）表示，兩組間的比較采用t檢驗，兩組以上之間的比較采用單因素方差分析，P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 LAMP2 表達

圖1 Western blot 結果顯示，與假手術組A 比較，組B 較細淺，組B 到組E 的條帶逐漸加深增粗，LAMP2 蛋白表達量呈現遞增的趨勢。尤其是10 倍劑量組E，兩條LAMP2 的蛋白條帶已經接近假手術組A 了。假手術組LAMP2 蛋白表達水平明顯高于模型組、常規、2 倍及10 倍劑量組，差異有統計學意義（P＜0.01）。模型組LAMP2 蛋白表達水平明顯低于假手術組、2 倍及10 倍劑量組（P＜0.01），與常規劑量組比較無統計學意義（P=0.230）。常規劑量組與假手術組，10 倍劑量組比較有統計學意義（P＜0.01），與模型組（P=0.230）、2 倍劑量組（P=0.136）比較無統計學意義。10 倍劑量組與假手術組、模型組、常規劑量組比較均有統計學意義（P＜0.01），與2 倍劑量組（P=0.071）比較無統計學意義。F=38.03，詳見表1。

圖1 LAMP2 蛋白表達（A：假手術組；B：模型組；C：常規劑量組；D：2 倍劑量組；E：10 倍劑量組）

表1 各組LAMP2 蛋白表達水平的比較（±s）

表1 各組LAMP2 蛋白表達水平的比較（±s）

注：與假手術組比較，aP ＜0.01；與模型組比較，bP ＜0.01；與常規劑量組比較，cP ＜0.01；與10 倍劑量組比較，dP ＜0.01

組別 例數 LAMP2 假手術組 模型組 常規劑量組2 倍劑量組10 倍劑量組1.00±0.00bcd 0.53±0.09ad 0.60±0.08ad 0.67±0.05ab 0.75±0.07abc 5 5 5 5 5

3 討論

腦缺血是一種死亡率和致殘率都較高的多因素疾病，尤其是對老年人的傷害比較嚴重。腦缺血發病率高，預后差，帶來的傷殘甚至死亡會給患者自身、家庭、社會都帶來沉重的負擔。在現代的中西醫治療中，均以疏通腦血栓、活血化瘀為原則。中藥方劑補陽還五湯是治療缺血中風的有效方劑，具有補氣、活血、通絡之效，主要治療由缺血性腦病、中風后遺癥等引起的半身不遂，肢體麻木，口眼歪斜等癥狀[6-7]。

研究表明，局灶性腦缺血損傷能活化自噬/溶酶體途徑，可致皮質區和海馬區的自噬體增多進而引起該區域溶酶體活性的增加[8-9]。自噬溶酶體系統能對自身胞質內的異物、損傷和衰老細胞器進行吞噬降解，以使細胞內的各種能量物質循環再利用進而維持細胞內環境的穩態，保證細胞正常生長和器官正常發育。自噬分為大自噬、小自噬、CMA，LAMP-2 蛋白是參與CMA 的關鍵分子。LAMP-2 是溶酶體膜上的單次跨膜蛋白，是一種重度糖基化1 型膜蛋白，與分子伴侶性自噬直接相關[10]。當細胞受到氧化性損傷時，細胞內蛋白暴露出KFERQ 序列，被作為分子伴侶的Hsc70 識別，形成分子伴侶-底物復合物，該復合物與溶酶體膜上的LAMP-2a結合，隨后溶酶體內的Lys-Hsc70 運送損傷蛋白質進入溶酶體內降解的過程，此過程為CMA。LAMP2a 在溶酶體膜上的表達水平直接決定了CMA 活性[11-12]。本實驗研究結果表明，假手術組的LAMP2 的蛋白表達量明顯高于其余各組（P ＜0.01），模型組的LAMP2 的蛋白表達低于假手術組、2 倍及10 倍劑量組（P ＜0.01），與常規劑量組的比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）。從結果看，常規劑量治療基本無效；2 倍劑量效果尚不明確，具體確定療效可能需要進一步增加樣本數；10 倍劑量治療效果肯定，但依舊低于假手術組，說明治療效果無法完全恢復正常。從實驗結果推測，補陽還五湯可能通過上調LAMP2 蛋白的表達使CMA 活性上調，CMA 活性上調在腦缺血時可選擇性地清除某些錯誤編輯的蛋白或受損的細胞器，維持神經細胞內環境的穩定，促進神經干細胞分化為神經細胞，幫助神經功能恢復，進而發揮神經保護作用。

本研究探討了補陽還五湯通過上調LAMP2 蛋白去激活可能存在的CMA 自噬途徑，揭示了補陽還五湯對腦缺血發揮神經保護作用的潛在新機制，但如何上調，如何激活的確切機制尚需進一步研究。如進一步通過電鏡觀察受損神經元是否有增加的自噬體出現，補陽還五湯治療后自噬體數量和超微結構的變化過程；保護腦缺血的自噬途徑信號通路中上、下游分子的作用等都還有待深入闡明，從而為預防和治療缺血性腦血管疾病提供更有效的作用靶點，為中醫藥防治疾病提供細胞層面的微觀依據。