左歸丸對大鼠缺血后腦損傷的神經(jīng)元保護機制

劉宏，易婭靜，代巧妹，楊婧，仲麗麗，李冀

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室；2.附屬第一醫(yī)院病理科；3.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院方劑學(xué)教研室，哈爾濱 150040）

中醫(yī)學(xué)“腎”的概念不同于西醫(yī)學(xué)，它包括的概念更廣。中醫(yī)認(rèn)為腎主生殖，能促進生殖器官的功能［1］。《靈樞·海論》說“ 腦為髓之海，腎主骨生髓通于腦”［2］。腎氣充足，腦有所養(yǎng)，腦清神碩。腎氣虧虛，則腦病易發(fā)［3-4］。左歸丸是傳統(tǒng)補腎名方，研究［5-7］顯示，左歸丸能發(fā)揮較好的神經(jīng)元保護作用。近年的研究［8-9］表明性激素是維持腦功能及保護腦組織作用的重要因子。本課題組前期研究［10］發(fā)現(xiàn)左歸丸能改善驚恐傷腎大鼠缺血后的腦損傷，并且上調(diào)神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達。但具體通路尚需進一步驗證。本研究從“雌激素-雌激素受體”角度探討左歸丸對大鼠缺血后腦損傷的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑

SPF 級8周齡SD雌性大鼠80只，體質(zhì)量 （250±20） g，購自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心 （許可證號：SYXK 黑2018005）。動物在標(biāo)準(zhǔn)條件下飼養(yǎng)［溫度 （25±1） ℃，濕度45%～50%］。左歸丸 （國藥準(zhǔn)字Z11020735） 購自北京同仁堂藥店，17β-雌二醇、生物素化山羊抗兔IgG （型號A0277） 購自中國碧云天公司，ERα購自中國Proteintech公司，ERβ購自中國Sangon公司，DAB顯色試劑盒、山羊血清購自中國Solarbio公司。MAP-2購自美國CST公司，Neun購自英國Abcam公司，DAPI購自中國Solarbio公司。

1.2 方法

1.2.1 去勢法構(gòu)建腎虛模型［11］：大鼠腹腔正中切口，沿子宮角導(dǎo)出卵巢，行雙側(cè)卵巢摘除。結(jié)扎、縫合。

1.2.2 線栓法構(gòu)建腦缺血再灌注模型：大鼠頸中部切開，于頸總動脈剪口，插入魚線，插入長度0.75 cm左右，視大鼠個體差異而定，以向前無法推動為準(zhǔn)。缺血1 h后拔出魚線，行缺血后再灌注 （ischemiareperfusion，IR） 24 h。

1.2.3 動物分組及給藥：80只SD大鼠隨機分為5組，每組16只。5組分別為假手術(shù)組 （僅剪口，不插栓線，不行卵巢摘除）、IR組、去勢+IR組、去勢+IR+中藥組、去勢+IR+雌二醇組。卵巢摘除術(shù)后開始給藥，17β-雌二醇 （100 μg/kg） 腹腔注射［12］，左歸丸湯劑灌胃 （1.62 g/kg），1次/d。第10天行腦缺血手術(shù)，缺血1 h，再灌注24 h。

1.2.4 穿越橫橋?qū)嶒灒翰捎肍EENEY等研發(fā)的穿越橫橋?qū)嶒?（beam walking test，BWT） 檢驗大鼠運動功能。檢測時間為大腦中動脈阻閉術(shù)后16、24、48、72 h和7 d。大鼠運動功能參考BWT評分法［13］分為7級 （0，完全不能穿過橫橋；7，正常通過）。

1.2.5 ELISA法檢測：行為學(xué)測試后 （第8天） 采用雙抗體夾心法測定大鼠雌激素含量。

1.2.6 2，3，5-三苯基四唑氯化銨 （triphenyltetrazolium chloride，TTC） 染色：行為學(xué)測試后 （第9天） 將腦組織切除并-20 ℃冷凍30 min，然后切成2 mm薄片 （冠狀切，每個腦組織切5片或6片）。1% TTC染色液37℃染色15 min。

1.2.7 HE染色：腦組織切片脫水、包埋，切片，用新鮮蘇木素-伊紅染色，常規(guī)脫水透明。

1.2.8 免疫熒光染色：石蠟包埋的大腦組織切成5 μm厚切片，60 ℃加熱30 min。脫蠟脫水后，抗原修復(fù)10 min。隨后山羊血清封閉30 min，在4 ℃隔夜兔單克隆抗體孵化：抗微管結(jié)合蛋白-2 （anti-microtubule binding protein-2，MAP2） （1 ∶200，上海北諾生物科技有限公司中國） 或抗神經(jīng)元核抗原 （anti-neuronal nuclear antigen，NeuN） （1 ∶2 000）。PBS洗 滌，cy3標(biāo)記的二抗IgG （1 ∶200，中國碧云天公司） 室溫孵育1 h，4，6-二氨基-2-苯基吲哚 （4，6-diamino-2-phenylindole，DAPI；合肥Biosharp公司） 復(fù)染后在熒光顯微鏡下觀察。

1.2.9 免疫組織化學(xué)：石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，過氧化物酶室溫封閉15 min，高火5 min，放入微波爐進行抗原修復(fù)，然后中火10 min，再高火5 min完成修復(fù)。一抗4 ℃過夜。滴加二抗，復(fù)染。

1.2.10 Western blotting檢測雌激素受體α （estrogen receptor α，ERα）與雌激素受體β （estrogen receptor β，ERβ） 蛋白含量：常規(guī)蛋白提取，轉(zhuǎn)膜，電泳，凝膠成像系統(tǒng)分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠運動功能檢測結(jié)果

大腦中動脈阻閉術(shù)后16 h、24 h、48 h、72 h、7 d各時間點大鼠運動功能檢測結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，IR組評分顯著降低 （P＜ 0.01）。與IR組比較，去勢+IR組評分明顯下降 （P＜ 0.05）；與去勢+IR組比較，去勢+IR+中藥組評分顯著升高 （P＜ 0.05）。去勢+IR+雌二醇組與去勢+IR+中藥組比較無統(tǒng)計學(xué)差異 （P＞ 0.05）。見表1。

2.2 各組大鼠梗死面積檢測結(jié)果

假手術(shù)組大鼠腦組織未見梗死灶。與假手術(shù)組比較，IR組大鼠腦組織梗死灶面積明顯增加 （P＜0.05），與IR組比較，去勢+IR組大鼠腦梗死灶面積明顯增加 （P＜ 0.05），與去勢+IR組比較，去勢+IR+中藥組大鼠腦組織梗死灶面積明顯減小 （P＜ 0.05），而去勢+IR+中藥組與去勢+IR+雌激素組大鼠腦梗死灶面積比較無統(tǒng)計學(xué)差異 （P＞ 0.05）。見圖1、表2。

表1 各組大鼠不同時間BWT評分比較Tab.1 Comparison of BWT score among different groups of rats at various timepoints

2.3 各組大鼠神經(jīng)元比較

假手術(shù)組大鼠神經(jīng)元排列正常，細(xì)胞核完整，IR組神經(jīng)元中觀察到核固縮、核碎裂、核消失。與IR組比較，去勢+IR組神經(jīng)元死亡更嚴(yán)重。與去勢+IR組比較，去勢+IR+中藥組或去勢+IR+雌二醇組神經(jīng)元丟失減少。見圖2。

2.4 各組大鼠雌激素水平比較

結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，IR組雌激素水平無統(tǒng)計學(xué)差異 （P＞ 0.05）。與IR組比較，去勢+IR組大鼠雌激素水平顯著降低 （P＜ 0.01）。與去勢+IR組比較，去勢+IR+中藥組雌激素水平明顯增高 （P＜0.01）。與去勢+IR+中藥組比較，去勢+IR+雌二醇組雌激素水平顯著升高 （P＞ 0.05）。見表2。

圖1 TTC染色測定的各組腦梗死面積Fig.1 Cerebral infarction area measured using TTC staining

2.5 各組大鼠雌激素受體表達比較

結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，IR組ERα和ERβ水平顯著升高。與IR組比較，去勢+IR組大鼠ERα和ERβ水平降低 （P＜ 0.05）。與去勢+IR組比較，去勢+IR+中藥組ERα和ERβ表達水平明顯上調(diào)。而去勢+IR+中藥組與去勢+IR+雌二醇組比較ERα和ERβ表達水平無統(tǒng)計學(xué)差異 （P＞ 0.05）。見圖3～5、表2。

表2 各組大鼠腦梗死面積、雌激素水平、雌激素受體表達比較Tab.2 Comparison of cerebral infarct area，estrogen level，and ER expression in rats from each group

圖2 各組神經(jīng)元HE染色結(jié)果×200Fig.2 HE staining of neurons ×200

圖3 各組大腦皮質(zhì)ERα的表達 DAB 染色×400Fig.3 ERα expression detected in the cerebral cortex of each group using DAB staining ×400

3 討論

臨床研究［14］表明，補腎法可以改善輕度認(rèn)知障礙，可以改善腦卒中患者的神經(jīng)功能。實驗研究［15］亦證實補腎中藥可以改善阿爾茲海默病大鼠的癡呆癥狀。研究［16］報道左歸丸含藥血清可以誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞分化，減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡。本課題組前期研究［17］結(jié)果顯示左歸丸可以明顯改善腦缺血大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力并增加神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達。

圖4 各組大鼠大腦皮質(zhì)ERβ的表達 DAB 染色×400Fig.4 ERβ expression detected in the cerebral cortex of each group using DAB staining ×400

圖5 各組大鼠海馬ERα和ERβ表達比較Fig.5 Comparison of ERα and ERβ levels in rat hippocampi in each group

本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，IR組大鼠穿越橫橋困難，BWT評分顯著降低，說明造模成功，大鼠有明顯腦缺血癥狀。與IR組比較，大鼠摘除卵巢后BWT評分顯著下降，說明卵巢摘除造成的雌激素缺失能夠加重缺血再灌注損傷。應(yīng)用左歸丸后大鼠BWT評分增加，說明左歸丸具有神經(jīng)元保護作用，可以使腦缺血性損傷減小，與前期研究結(jié)果一致。TTC染色及HE染色結(jié)果顯示大腦中動脈阻閉造成的缺血梗死灶出現(xiàn)在皮層下或者紋狀體區(qū)，梗死中心區(qū)細(xì)胞變性壞死，梗死半暗帶細(xì)胞丟失嚴(yán)重，排列紊亂，水腫現(xiàn)象明顯，說明缺血對腦組織造成了形態(tài)和功能的損傷性改變，大鼠卵巢摘除后形態(tài)學(xué)損傷較單純?nèi)毖黠@加重，梗死面積增大。左歸丸治療后缺血腦明顯改善，梗死面積減小，神經(jīng)元丟失減少。神經(jīng)保護作用左歸丸與雌二醇相似。由此證實左歸丸對缺血性腦損傷有確切的保護作用。

近年的研究［18］發(fā)現(xiàn)雌激素有明顯的腦保護作用。中醫(yī)傳統(tǒng)理論認(rèn)為“腎藏精”，主男女生殖之精［19］。已有研究［20］指出中醫(yī)“腎主生殖”理論與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)“下丘腦-垂體-卵巢軸” 調(diào)節(jié)方向大致相同。大量研究［21-22］表明補腎中藥具有促性激素樣作用。LAI 等［23］研究發(fā)現(xiàn)左歸丸對卵巢摘除小鼠發(fā)揮防治骨丟失的效果，因而具有雌激素樣作用。本研究結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠腦皮質(zhì)區(qū)ERα、ERβ僅有少量表達，說明正常情況下ERα、ERβ在腦內(nèi)表達量較少；IR組大鼠腦皮質(zhì)半暗帶神經(jīng)元ERα、ERβ的表達均明顯高于假手術(shù)組，說明缺血刺激調(diào)動了機體的保護性機制，上調(diào)了ERα、ERβ的表達。可見ERα、ERβ均參與缺血后的腦保護。左歸丸干預(yù)后大鼠 ERα、ERβ的表達均明顯高于去勢+IR組，說明左歸丸可上調(diào)ERα、ERβ的表達，激活雌激素-雌激素受體通路發(fā)揮腦保護作用。

綜上所述，左歸丸通過“雌激素-雌激素受體”通路對大鼠缺血性腦損傷發(fā)揮保護作用，“雌激素-雌激素受體”可能是“腎腦相關(guān)”的關(guān)鍵通路之一。“腎通于腦”中醫(yī)理論博大精深，可能關(guān)系到諸多現(xiàn)代生物分子機制，具體機制有待進一步驗證和探索。