DNA損傷修復通路因子53BP1在骨髓干細胞自我更新和分化發育中的作用

尤放，王美蓮

（中國醫科大學基礎醫學院病原生物學教研室，沈陽 110122）

維持基因組序列信息的完整性對于生物體的存在至關重要，細胞應對各種類型損傷因子所導致的DNA損傷主要是通過激活復雜而精細的DNA損傷應答 （DNA damage response，DDR） 通路［1］。具有細胞毒性的雙鏈斷裂損傷 （double strand breaks，DSBs） 是最為嚴重的DNA損傷形式之一，未得到正確處理的DSBs除可增加細胞的致死率外，還會增加癌癥的易感性［2］。53BP1（P53 binding protein 1） 是一種蛋白質編碼基因，在DSBs損傷相關信號轉導通路中扮演極其重要的角色，主要參與并影響DSBs的修復決策［3］。53BP1是脊椎動物芽殖酵母Rad9和裂殖酵母Crb2/Rhp9檢查點蛋白的直系同源蛋白。作為進化保守的DNA損傷檢查點蛋白家族的一員，53BP1與p53結合可調節細胞周期進程和細胞增殖［4］。DSBs發生后，因損傷周圍的染色質性質發生變化，高度磷酸化的53BP1迅速聚集于斷裂位點。53BP1通過調控DNA末端處理方式及DSBs的動力學過程來避免產生突變修復的結果［5］。

近年來，對53BP1相關功能的探索一直是國內外科研領域的研究熱點，53BP1與諸多體內生理反應間均存在聯系，本研究擬探討53BP1對骨髓干細胞 （bone marrow stem cell，BMSC） 自我更新及分化的影響，從干性細胞周期檢查點入手，著眼于53BP1對BMSC數量和質量的控制，重點研究53BP1與BMSC自我更新及分化過程的內在聯系。

1 材料與方法

1.1 動物、細胞及主要試劑

C56/7小鼠購自遼寧長生生物技術有限公 司，C2C12細胞由本實驗室保存，ProCount Progenitor Cell Enumeration Kit （美國BD公司），HRPlabeled Goat Anti-Mouse IgG （H+L）（北京鼎國生物技術有限公司），Anti-53BP1抗體（美國Novus Biologicals公司），Anti-Mouse-CD117 （c-Kit） PE抗體（美國PeproTech公司），Anti-Mouse-Ly6A/E （Sca-1） -Biotin抗體（英國Abcam公司），Lineage Cell Dection Cocktail-Biotin，Mouse組合抗體 （德國Miltenyi Biotec公司），FITC anti-mouse CD4 和粒系分化抗原-1 （granulocyte differentiation antigen-1，Gr-1）單克隆抗體 （美國Lsbio公司）。

1.2 構建53BP1全身敲除小鼠模型

以小鼠53BP1的cDNA片段為探針從129小鼠基因組DNA噬菌體文庫中分離出53BP1小鼠基因組DNA，克隆至 pZErO-2質粒，通過將外顯子替換構建靶向載體，線性化后電轉入129/Sv小鼠的胚胎干細胞 （embryonic stem cells，ESCs） 中。利用分子雜交篩選出約200個G418抗性ES克隆。靶向注射獲得嵌合體小鼠后同C57/6小鼠雜交，成功雜交鼠將用于獲得53BP1-/-小鼠。此外，選取3 d的胚胎獨立培養，并嚴格按照國際標準程序建立胚胎細胞系。

1.3 細胞分選及其表面分子標記檢測

1.3.1 小鼠骨髓細胞的分離和計數：麻醉后處死小鼠，消毒后分離雙側股骨和左右脛骨，小心剔除軟組織，抽取2 mL的緩沖液徹底沖洗骨髓腔，獲得骨髓血后，使用濾器及篩網過濾，胰蛋白酶消化30 min，加入2 mL的伊斯科夫改良的杜貝克培養基（Iscove’s modified Dubecco’s medium，IMDM） 1 000 r/min離心5 min，制備單細胞懸液，基于2個脛骨和2個股骨包含小鼠體內所有骨髓細胞25%的假設，通過細胞分析儀進行計數。

1.3.2 細胞分選：使用2 mL IMDM沖洗骨髓細胞，加入Gey’s Lysis Buffer，冰上孵育10 min。用預混的抗體混合物于冰上標記30 min，加入1 ∶100稀釋的鏈霉親和素結合的量子紅 （streptavidin-conjugated quantum red，SAQR） 試劑，免疫染色30 min。流式細胞分選儀進行分選，每個樣本取40×106進行染色分選，流速控制為約200/s，分選純度≥97%。

1.3.3 細胞表面分子標記檢測：收集待染細胞，進行染色和固定，上機檢測，打印本次實驗分析報告。

1.4 細胞培養及誘導分化

C2C12細胞培養于杜貝克改良培養基（Dulbecco’s modified Eagle’s medium，DMEM），放置于CO2振蕩孵箱中培養。誘導分化培養基由添加2%馬血清的DMEM組成，當細胞融合率達90%，更換為分化培養基 （differentiation medium，DM）。分選獲得的KSL細胞培養于IMDM，需向其中添加相應細胞因子混合物。

粒細胞-巨噬細胞集落形成單位 （granulocytemacrophage colony forming unit，CFU-GM） 體外檢測跟據加拿大STEMCELL Technologies公司的生產商指示說明進行操作。培養5～7 d后，評估菌落形成的數量。

1.5 53BP1表達檢測

1.5.1 DAPI熒光染色觀察53BP1表達情況：細胞預處理，使用預冷的甲醇固定，Triton X-100透膜，PBS清洗，DAPI染色，封片，熒光顯微鏡下觀察并拍照留存。

1.5.2 Western blotting檢測53BP1蛋白的表達含量：提取細胞總蛋白，并進行蛋白質濃度測定，RIPA稀釋后，取樣進行SDS-PAGE電泳，轉膜，封閉，抗體雜交，ECL化學發光。

1.6 Co-IP檢測磷酸化修飾蛋白

免疫共沉淀 （co-immunoprecipitation，Co-IP）：加入750 μL細胞裂解液，用細胞刮刀刮取細胞，轉移至EP管中，冰上裂解30 min，每間隔10 min，使用渦旋儀混合5 s，4 ℃，13 000 r/min離心10 min，吸取上清，4 ℃過夜；次日，渦旋磁珠5 min，取30 μL重懸的磁珠，PBS洗滌，于磁力架上進行磁性分離；加入500 μL預先稀釋的相應抗體，孵育15 min，每間隔5 min使用渦旋混勻器5 s，磁性分離后收集磁珠，變性洗脫，吸取上清，煮樣5 min進行SDS-PAGE電泳。

1.7 統計學分析

收集相關數據，分對照組 （WT） 和實驗組 （Mut）2組。采用SPSS 22.0進行統計學分析，計量資料以表示，采用雙側t檢驗進行比較，Graphpad Prism 8.0制圖，P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 53BP1對小鼠胚胎形成和細胞分化的影響

伴隨小鼠胚胎不斷發育形成，53BP1表達呈下降趨勢，12 d可見WT組53BP1大量表達，Mut組無表達，16 d觀察到WT組53BP1表達顯著減少，Mut組無表達，18 d 2組均未觀察到53BP1表達，見圖1A。伴隨ESCs、KSL細胞和C2C12細胞分化發育過程進行，53BP1表達呈上升趨勢，表達量均顯著增加。24 h見53BP1微量表達，48 h后53BP1表達增加，主要位于細胞質中，72 h觀察見53BP1逐漸由胞質向細胞核擴散，最終大量彌散表達于所有ESCs中，見圖1B。伴隨KSL細胞分化進行，53BP1表達遞增，5 d 2組均未觀察到53BP1的表達，10 d可見WT組53BP1在KSL細胞中大量表達，Mut組無表達，見圖1C。就C2C12細胞而言，1 d未觀察到53BP1的表達，4 d可見53BP1的表達量顯著增加，見圖1D。以上結果表明53BP1主要作用于小鼠胚胎形成早期，伴隨ESCs、C2C12細胞及KSL細胞的分化進行，53BP1表達量顯著增加，證實了53BP1參與BMSC的分化發育過程。

2.2 53BP1對KSL細胞總數、細胞周期及表面分子標記的影響

結果顯示，53BP1參與并影響KSL細胞的自我更新過程，53BP1基因敲除可影響KSL細胞分化過程中表面分子標記的表達。53BP1基因敲除使得KSL細胞總數較之于WT組顯著減少，WT組KSL細胞數量為0.093±0.010，Mut組KSL細胞數量為0.033±0.006，差異有統計學意義 （P=0.003），見圖2A。53BP1基因敲除與否并不顯著影響處于細胞周期靜息期 （G0期） 及細胞間期 （G1期） 的KSL細胞百分含量，G0期WT組KSL細胞百分含量為88.333±5.774，Mut組KSL細胞百分含量為86.667±3.055，差異無統計學意義 （P=0.681）；G1期WT組KSL細胞百分含量為11.667±5.774，Mut組KSL細胞百分含 量為13.333±3.055，差異無統計學意義 （P=0.681），見圖2B。53BP1基因敲除使得KSL細胞表面干性分子標記CD34+表達較之于WT組顯著減少，WT組CD34+KSL細胞數量為0.073±0.014，Mut組CD34+KSL細胞數量為0.013±0.007，差異有統計學意義 （P=0.007），見圖2C。53BP1基因敲除與否并不顯著影響KSL細胞表面標記CD34-的表達，WT組CD34-KSL細胞數量為0.021±0.001，Mut組CD34-KSL細胞數量為0.020±0.003，差異無統計學意義（P=0.789），見圖2D。53BP1基因敲除與否并不顯著影響體外培養的KSL細胞的生長速率，差異無統計學意義 （P=0.742），見圖2E。53BP1基因敲除使得體外培養的KSL細胞伴隨分化進行，其表面分子標記Mar/Gr-1+百分含量顯著增加，WT組Mar/Gr-1+相對百分含量為24.250±5.737，Mut組Mar/Gr-1+相對百分含量為49.250±12.580，差異有統計學意義 （P=0.011），見圖2F；53BP1基因敲除使得KSL細胞表面標記CD45+表達則明顯減少，WT組CD45+KSL細胞數量為34.500±4.796，Mut組CD45+KSL細胞數量為15.750±4.349，差異有統計學意義 （P=0.001），見圖2G。

2.3 53BP1對PBL細胞定向分化的影響

53BP1基因敲除使得外周血淋巴細胞 （peripheral blood lymphocytes，PBL） 定向分化產生的單核細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞較WT組均顯著增加，差異有統計學意義 （P分別為＜0.001、0.004和0.002）。結果顯示，53BP1可影響BMSC的分化發育過程，53BP1基因敲除可使定向分化產生的單核細胞、嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞細胞顯著增加。見圖3。

2.4 53BP1對磷酸化修飾蛋白表達的影響

53BP1基因敲除可顯著影響磷酸化修飾蛋白p-H4 （k20）、p-H3 （k79）、p-ATM和p-53-Ser20的表達水平。53BP1基因敲除上調了p-H4 （k20） 和p-H3 （k79）2種磷酸化修飾蛋白的表達水平，WT組未觀察到上述2種蛋白的表達；此外，53BP1基因敲除導致p-ATM和p-53-Ser20蛋白表達顯著減少，見圖4。

3 討論

圖4 53BP1對磷酸化修飾蛋白表達的影響 ×200Fig.4 Effect of 53BP1 on the expression of phosphorylated proteins ×200

ESCs具有較高的同組重組 （homologous recombination，HR） 發生頻率，并伴有DSBs修復。延遲ESCs中細胞周期G1/S的轉變可形成含有53BP1的核小體，并抑制ssDNA的堆積［6］。C2C12細胞作為經典成體干細胞模型，來源于小鼠成肌細胞株的亞克隆，在體外經誘導分化，可形成富含蛋白質的多核肌管［7］。造血干細胞 （hematopoietic stem cells，HSCs） 缺乏成熟血細胞標志物的表達，不表達Lin家族蛋白，故被稱為Lin-細胞。c-kit的表達是HSCs的主要表型特征，作為受體與其配體干細胞因子 （stem cell factor，SCF）的相互作用可觸發一系列信號轉導事件。小鼠骨髓中的KSL細胞，即表達c-kit和Sca-1的Lin-細胞群，具有極強的多向分化潛能和自我更新能力，可在體外培養條件下進行細胞增殖及分化［8］。伴隨ESCs、C2C12細胞和KSL細胞分化的進行，53BP1表達量均顯著增加，這證實了本研究關于53BP1可影響BMSC分化發育過程的推測。

CD34+可廣泛高水平表達于早期造血干/祖細胞，隨著細胞不斷成熟，其表達則呈進化性下降，乃至最終消失，可作為多能干細胞向髓系定向分化的標志［9］。經γ射線輻射誘導后CD34+的HSCs相比于成熟淋巴細胞，53BP1蛋白的招募水平提升，DNA修復能力亦隨之增強［10］。Gr-1高水平表達于中性粒細胞表面，亦可表達于記憶型T細胞以及樹突狀細胞的表面。腫瘤浸潤的Gr-1+骨髓細胞可拮抗衰老［11］。CD45分子可選擇性表達于除紅細胞、血小板和漿細胞以外的所有造血細胞表面。髓系細胞的成熟度和分化程度越高，其表達CD45分子量相應也越多［12］。53BP1基因敲除使得KSL細胞表面標記Mar/Gr-1+百分含量顯著增加，而CD34+和CD45+分子標記表達則明顯減少，提示53BP1參與并影響KSL細胞的自我更新及分化發育過程，53BP1基因敲除可影響KSL細胞表面分子標記的表達。

細胞周期靜息期 （G0期） 細胞隨暫時停止分裂活動但仍保存相應潛力，受刺激后亦可繼續進行增殖，而細胞間期 （G1期） 則作為細胞周期調節主要階段，其阻留決定了細胞周期的進展方向。53BP1基因敲除與否并不顯著影響處于細胞周期G0/G1的KSL細胞百分含量。53BP1基因敲除后，發現KSL細胞的生長曲線較之于WT組稍有下降，但并不顯著。

p-H4 （k20） 可伴隨有絲分裂細胞周期的進展顯著增加，p-H3 （k79） 同信號轉導和基因轉錄密切相關［13］。p-ATM在DNA修復的激活、多種致癌途徑以及基因組完整性的維持中起扮演關鍵角色［14］。p-53-Ser20的存在對細胞生長具有抑制作用［15］。本研究發現53BP1基因敲除后p-H4 （k20） 和p-H3 （k79）含量顯著增多，但p-ATM和p-53-Ser20顯著減少，據此推測53BP1可影響這4種磷酸化蛋白的表達水平，進而影響BMSC的自我更新和分化發育過程。

綜上，DNA損傷通路因子53BP1參與并影響BMSC的自我更新及定向分化過程，這一結論將為日后對于53BP1功能更為深入的探索提供新的理論基礎與支撐，使其進入更加廣闊的研究領域。