馬齒莧多糖對幼年糖尿病大鼠糖脂代謝、腎功能的影響及其作用機制

王成祥，劉玉霞，常紹鴻，邢二慶，謝遂亮

（1.新鄉市中心醫院兒科，河南 新鄉 453000；2.新鄉醫學院第四臨床學院兒科，河南 新鄉 453000）

近年來，兒童糖尿病患病人數逐年上升［1］。兒童患者多為1型糖尿病，由于兒童生長發育過程中食物消耗及運動量變化大，1型糖尿病患兒血糖較難控制，且由于發病早、病程長，后期多出現并發癥，嚴重危害患者的生命健康［1］。糖尿病腎病是糖尿病患者死亡主要原因之一，也是終末期腎病的主要病因，如何保護糖尿病患者腎臟功能亦是重要研究課題。已有研究發現，高糖環境能夠刺激轉化生長因子β1 （trasnforming growth factor β1，TGF-β1）大量分泌，TGF-β1與Smad-3蛋白結合刺激炎癥細胞聚集，誘發結締組織生長因子 （connective tissue growth factor，CTGF）增加，促進糖尿病腎病進展［2］；而抑制TGF-β1/Smad3信號通路能夠保護腎功能［3］。

馬齒莧是我國常見草本植物，具有清熱解毒、止消渴、去腫消炎等作用，主治腹瀉、癤癰、皮炎、丹毒、痢疾等疾病［4］。近年來研究發現，馬齒莧具有降血糖、降血脂等效果。研究顯示，服用馬齒莧能夠改善糖尿病患者的血糖水平［5］；馬齒莧多糖亦能夠改善糖尿病大鼠的血糖水平［6］。但馬齒莧對幼年糖尿病大鼠影響未見報道。本研究探討馬齒莧多糖對幼年糖尿病大鼠的糖脂代謝、腎功能的影響及其可能的作用機制，旨在為臨床兒童糖尿病防治提供新的思路和研究基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及藥品

4周齡雄性SD大鼠63只，SPF級，體質量90～108 g，購自北京維通利華公司。鏈脲佐菌素 （streptozotocin，STZ）購自美國Sigma公司，HE和PAS染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。TGF-β1、Smad3和CTGF多克隆兔抗購自英國Abcam公司；β-actin多克隆鼠抗、羊抗兔、羊抗鼠二抗購自中杉金橋有限公司；蛋白質定量試劑盒 （Bradford法，P1510）購自北京普利萊基因技術有限公司；ECL化學發光液購自美國Millipore公司。

馬齒莧多糖提取見文獻［7］，馬齒莧全株洗凈烘干后粉碎，分別使用石油醚脫脂和95%乙醇回流提取各2次，濾渣干燥后，加入20倍水70 ℃ 250 W超聲30 min提取2次，提取液抽濾后置于75%乙醇24 h后過濾，洗滌干燥后得到馬齒莧多糖，提取率約為6.5%。

1.2 動物分組及模型建立

63只SD雄性大鼠，喂養7 d適應環境后，測量空腹血糖均為正常值。隨機分為對照組 （Con組，n=20，正常飲食），另外43只大鼠高脂飲食4周后，后腹腔一次性注射STZ （60 mg/kg），72 h后測量大鼠尾靜脈血糖，血糖＞16.7 mmol/L則表示2型糖尿病大鼠造模成功。3只血糖不達標大鼠淘汰。40只造模成功大鼠隨機分為糖尿病模型組 （Mod組）和馬齒莧多糖組 （PP組），每組20只。PP組采用馬齒莧多糖［200 mg/ （kg· d）］灌胃，Mod組和Con組給予等體積生理鹽水灌胃，連續干預6周。

1.3 糖脂代謝、腎功能指標測定

3組大鼠分別在干預6周后剪尾取血，離心留取血清，采用全自動生化儀測甘油三酯 （triglyceride，TG）、總膽固醇 （total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白膽固醇 （low density lipoprotein cholesterol，LDLC）、尿素氮、肌酐、24 h尿蛋白。計算腎指數 （kidney weight index，KWI），KWI （mg/g）=腎質量/體質量。血糖儀測定大鼠空腹血糖 （fasting blood glucose，FBG）。

1.4 腎組織HE染色和PAS染色

干預6周后處死3組大鼠，取腎，低溫冰凍切片，晾干后先用二甲苯脫脂、蘇木素液染色、鹽酸乙醇分色、伊紅染液染色，再放入梯度濃度乙醇溶液中脫水 （100%、95%、85%、70%、50%乙醇各放置3 min），然后在蒸餾水中浸泡2 min透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察HE染色結果。冰凍切片入蒸餾水浸洗，乙醇固定10 min，置入過碘酸溶液5 min，蒸餾水沖洗，干燥后放入雪夫染液30 min，蒸餾水沖洗后蘇木精復染，清洗、透明、封片觀察。

1.5 腎組織免疫組化

干預6周后取腎組織，4%甲醛固定，梯度乙醇脫水，二甲苯脫脂，包埋切片，3%過氧水室溫20 min孵育，蒸餾水沖洗3次，TGF-β1、Smad3和CTGF一抗室溫孵育60 min，PBS漂洗3次后二抗室溫孵育30 min，PBS漂洗3次，DAB染色 （15 ℃，10 min），PBS漂洗3次，最后再經蘇木素復染，樹膠封片后觀察。隨機選取每只大鼠組織切片3張，每張隨機抽取5個視野，用平均光密度值作為統計數值，采用Image J軟件統計分析。

1.6 Western blotting檢測

大鼠干預6周后灌注固定取腎組織，放置于冰上研磨腎組織，加入蛋白裂解液，4 ℃離心30 min，根據試劑盒說明進行操作，采用Bradford法定量計算。取相同量的樣品進行12%凝膠電泳 （SDS-PAGE），轉移到PVDF膜上，然后用5%脫脂奶粉過夜，封閉阻斷抗體，TGF-β1、Smad3和CTGF多克隆兔抗和β-actin多克隆鼠抗采用0.5%BSA溶液稀釋，室溫下孵育2 h后TBST洗膜10 min，重復3次；羊抗兔、羊抗鼠二抗采用0.5%BSA溶液稀釋，室溫下孵育2 h后TBST洗膜 15 min，重復3次，加入ECL試劑，凝膠成像儀觀測。

1.7 統計學分析

2 結果

2.1 3組大鼠血脂水平比較

結果顯示，與Con組比較，Mod組TG、TC和LDLC水平顯著升高，差異有統計學意義 （P＜ 0.01）；與Mod組比較，PP組TG、TC和LDLC水平顯著降低，差異有統計學意義 （P＜ 0.01）。見表1。

表1 3組大鼠血脂水平比較 （mmol/L）Tab.1 Comparison of blood lipid levels among three groups （mmol/L）

2.2 3組大鼠血糖和腎功能比較

結果顯示，與Con組比較，Mod組FBG、KWI、尿素氮、肌酐和尿蛋白顯著升高，差異有統計學意義 （P＜ 0.01）；與Mod組比較，PP組FBG、KWI、尿素氮、肌酐、尿蛋白顯著降低，差異有統計學意義 （P＜ 0.01）。見表2。

2.3 3組大鼠HE染色及PAS染色結果

HE染色結果顯示，Con組腎組織形態正常；Mod組系膜細胞增生，基底膜增厚，腎小管腫脹，管腔狹窄，間質可見大量滲出紅細胞；PP組HE染色表現與Mod組相同，但腎組織受損程度明顯減輕。見圖1。PAS染色主要為糖類著色，Con組PAS染色較淡，未見明顯糖原沉積，而Mod組大量糖原在腎單位沉積，PP組PAS染色表現與Mod組相同，但腎組織受損程度明顯減輕。見圖2。

2.4 3組大鼠免疫組化結果

TGF-β1、Smad3和CTGF是TGF-β1/Smad通路的關鍵蛋白，主要在胞質表達，免疫組化顯示為棕黃色。免疫組化結果顯示，與Con組比較，Mod組腎組織TGF-β1、Smad3和CTGF陽性表達明顯增高，差異具有統計學意義 （P＜ 0.05）。與Mod組比較，PP組腎組織TGF-β1、Smad3和CTGF陽性表達明顯下降，差異有統計學意義 （P＜ 0.05）。見圖3、表3。

表2 3組大鼠血糖水平及腎功能比較Tab.2 Comparison of blood glucose level and renal function among three groups

圖1 3組大鼠腎組織HE染色結果×400Fig.1 HE staining results of renal tissue among three groups×400

圖2 3組大鼠腎組織PAS染色結果×400Fig.2 PAS staining results of renal tissue among three groups×400

圖3 各組大鼠腎組織TGF-β1、Smad3和CTGF陽性表達比較 ×400Fig.3 The positive expressions of TGF-β1，Smad3 and CTGF in renal tissues of rats in each group ×400

表3 3組大鼠TGF-β1、Smad3和CTGF陽性表達及蛋白表達比較Tab.3 Comparison of positive expression and protein expression of TGF-1，Smad3 and CTGF in three groups

2.5 3組大鼠腎臟組織TGF-β1、Smad3和CTGF蛋白表達比較

Western blotting結果顯示，與Con組比較，Mod組、PP組TGF-β1、Smad3和CTGF表達明顯增加，差異有統計學意義 （P＜ 0.05）。與Mod組比較，PP組TGF-β1、Smad3和CTGF的表達明顯降低，差異有統計學意義 （P＜ 0.05）。見表3、圖4。

圖4 3組大鼠腎組織TGF-β1、Smad3和CTGF蛋白表達Fig.4 The protein expression of TGF-β1，Smad3 and CTGF in renal tissues of rats in three groups

3 討論

馬齒莧多糖是馬齒莧的主要有效成分，研究發現，馬齒莧能夠改善糖尿病血糖水平［8-9］；能夠通過NF-κB信號通路改善糖尿病肝功能損害［9］。馬齒莧種子能夠降低糖尿病患者血糖水平和血脂水平［10］，改善動脈粥樣硬化［5］；亦能夠降低血壓［11］。馬齒莧提取物能夠改善肥胖［12］和高糖誘導的認知功能受損［13］。馬齒莧提取物能夠降低糖尿病患者血壓和糖化血紅蛋白水平［14］。本研究結果顯示，馬齒莧多糖能夠降低幼年糖尿病大鼠血糖和血脂水平，與以往研究結果一致。幼年糖尿病大鼠PAS染色可見大量糖原沉積，胞外基質增多，KWI增高，提示腎臟肥大，而馬齒筧多糖能夠改善幼年糖尿病大鼠腎單位糖類沉積，改善系膜增生及腎臟肥大，降低肌酐、尿素氮、KWI、24 h尿蛋白水平，提示馬齒莧多糖能夠減輕幼年糖尿病導致腎功能損害，對腎功能有保護作用。

TGF-β1/Smad3信號通路在腎纖維化進程中起關鍵作用。TGF-β1是腎纖維化起始因子，在高糖環境下大量分泌激活后與Smad-3蛋白結合，刺激炎癥細胞聚集，引起級聯反應，促進下游CTGF大量分泌，導致腎小管上皮增生，腎臟纖維化進展，最終導致腎功能衰竭［15］。研究顯示，早期糖尿病腎病發生發展與TGF-β1/Smad3信號通路上調密切相關［16］，高糖環境能夠誘導腎小球上皮細胞TGF-β1高表達［17］，抑制該通路能夠保護腎功能，延緩糖尿病腎病進展［3］。本研究結果顯示，與Con組比較，Mod組TGF-β1、Smad3和CTGF蛋白表達明顯增加 （P＜ 0.05）；而與Mod組比較，PP組能夠顯著降低TGF-β1、Smad3和CTGF蛋白表達 （P＜ 0.05），提示馬齒莧多糖可能通過TGF-β1/Smad3信號通路保護腎功能。

綜上所述，馬齒莧多糖能夠改善幼年糖尿病大鼠的糖脂代謝，降低尿蛋白水平，并且對幼年糖尿病大鼠腎功能起保護作用，其機制可能與TGF-β1/Smad3信號通路有關。