基于網絡藥理學探討當歸-菟絲子治療多囊卵巢綜合征的作用靶標和信號通路

王翠翠，馬曉欣

（中國醫科大學附屬盛京醫院婦產科，沈陽 110022）

多囊卵巢綜合征 （polycystic ovary syndrome，PCOS）是育齡期女性最常見的婦科內分泌疾病，通常表現為高雄激素血癥和排卵障礙。其病因尚不明確，可能是遺傳因素與環境因素共同作用的結果。臨床上主要采取個性化的對癥治療，以達到滿足生育要求、緩解臨床癥狀的目的。從中醫角度，PCOS辨證多為臟腑功能失調、痰淤阻滯、虛實夾雜，臨床常見有腎虛、痰濕、氣血淤滯、肝經郁熱等類型，故現代醫者多從腎、脾、肝論治PCOS，在調節臟腑功能同時，注重活血燥濕化痰，從而使氣血正常運行，排卵如常，胞宮按時滿溢［1］。借助中醫傳承輔助系統，得到治療PCOS使用頻率最高且藥物組合頻數最多的兩味中藥——當歸和菟絲子［2］。當歸味苦、溫，無毒，首要功效是補氣和血，最宜用于婦女月經不調。菟絲子甘、溫，歸腎、肝、脾經，具有滋補肝腎、固精縮尿、安胎、明目、止瀉之功效。菟絲子還有雌激素樣作用，可促進雌性動物卵巢和子宮發育，促進排卵［3］，具體機制尚不明確。網絡藥理學是基于系統生物學的理論，對藥物的有效成分進行多靶點、多途徑的生物系統網絡分析。本文運用網絡藥理學方法篩選當歸-菟絲子兩味中藥的活性成分，預測其與PCOS相關的靶標與信號通路，構建疾病-藥物-成分-靶標的網絡，分析當歸-菟絲子治療PCOS可能涉及的作用靶標和信號通路。

1 材料與方法

1.1 當歸-菟絲子活性成分的獲取

利用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php） 檢索當歸和菟絲子兩味藥物所有的化學成分。根據藥代動力學原理和平臺推薦，在檢索結果中限定口服生物利用度≥30%且類藥性≥0.18，獲得的化學成分作為當歸和菟絲子兩味中藥的活性成分。

1.2 當歸-菟絲子活性成分對應靶標的獲取

再次利用TCMSP檢索當歸和菟絲子所有活性成分對應的靶標，并通過Uniprot數據庫 （https：//www.uniprot.org） 獲取候選靶標對應的基因ID。

1.3 PCOS疾病靶標的獲取

分別檢索GeneCards數據庫 （https：//www.genecards.org） 和基因疾病關聯數據庫 （DisGeNET，http：//www.disgenet.org） 中與PCOS相關的靶基因，去重、合并，獲得所有基因數據，將當歸-菟絲子的活性成分對應的靶標與疾病的靶標共同映射繪制韋恩圖，獲得活性成分治療PCOS的潛在作用靶標。

1.4 藥物-成分-疾病靶標網絡圖構建

運用Cytoscape軟件 （3.7.2版本） 將藥物-成分-疾病靶標的網絡關系可視化，以進一步了解當歸和菟絲子兩味中藥的活性成分與治療PCOS潛在作用靶標的對應關系。

1.5 靶標蛋白相互作用網絡構建

將當歸-菟絲子治療PCOS潛在作用的靶蛋白導入蛋白質相互作用數據庫 （STRING，https：//stringdb.org），限定物種為人，產生蛋白-蛋白相互作用網絡，設置最小蛋白間相互作用分值為0.9，將結果以TSV格式導出，并利用R語言 （https：//www.r-project.org） 將每個潛在靶標的連接度進行排序，并以柱狀圖的形式列出前30位的關鍵靶標基因。

1.6 基因本體注釋 （gene ontology，GO） 生物學過程及京都基因與基因組百科全書 （Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG） 通路分析

將當歸和菟絲子治療PCOS的潛在靶標基因ID導入DAVID數據庫［4］（https：//david.ncifcrf.gov/summary.jsp），進行GO和KEGG代謝通路富集分析。選取滿足校正后P＜ 0.05且Q＜ 0.05的生物學過程和通路，并根據校正后的P值升序排序，選取前20條，使用R語言繪制柱狀圖。

2 結果

2.1 當歸-菟絲子的活性成分及對應靶標

從TCMSP中共獲取當歸的化學成分125種，菟絲子的化學成分29種。篩選出當歸的活性成分2種，菟絲子的活性成分11種，重復1種，見表1。同時，在數據庫中獲取當歸和菟絲子活性成分的對應候選靶標共375個，其中菟絲子活性成分sophranol未找到相應靶標，故當歸-菟絲子關鍵有效的活性成分共11種。

2.2 當歸-菟絲子的活性成分治療PCOS的潛在作用靶標預測

在Uniprots數據庫中輸入靶標名稱，獲得375個候選靶標的相應基因。將其與GeneCards數據庫和DisGeNET數據庫檢索到的與PCOS疾病有關的靶基因相映射，用韋恩圖篩選出當歸-菟絲子治療PCOS的潛在作用靶標共135個。

2.3 當歸、菟絲子-活性成分-潛在作用靶標網絡構建

根據當歸、菟絲子兩味中藥共包含的11種關鍵有效的活性成分，以及對應的135個與PCOS相關的潛在作用靶標，導入Cytoscape軟件進行網絡構建，并給予可視化展示。藥物-活性成分-潛在作用靶標網絡圖共包括148個節點，其中當歸-菟絲子的關鍵活性成分11種，與PCOS相關的135個潛在作用靶標形成382種對應關系，見圖1。其中紅色代表疾病PCOS，黃色代表當歸-菟絲子，紫色代表兩味中藥中關鍵有效的活性成分，綠色代表兩味中藥與疾病有關的潛在作用靶標，相連的線表示兩味中藥與有效活性成分、有效活性成分與疾病靶標的對應關系。

表1 當歸-菟絲子的活性成分Tab.1 Active ingredients in Angelicae Sinensis Radix-Cuscutae Semen

圖1 當歸-菟絲子的關鍵活性成分與疾病靶標的網絡Fig.1 Network of the key active ingredients of Angelicae Sinensis Radix-Cuscutae Semen and the disease targets in PCOS

2.4 當歸-菟絲子靶標蛋白相互作用網絡

將當歸-菟絲子中具有治療PCOS作用的潛在作用靶標導入STRING數據庫，從而獲得蛋白質之間相互作用的網絡圖，共135個節點和418條邊，結果以TSV文件導出，并利用R語言將每個靶標的鄰接節點數進行統計排序，排名前30名的靶標用柱狀圖的形式進行可視化展示，見圖2。其中AKT1的鄰接節點為29個，JUN鄰接節點為28個，MAPK1的鄰接節點為26個，IL-6的鄰接節點為20個，雌激素受體1 （estrogen receptor alpha，ESR1） 的鄰接節點為19個。說明這幾個基因可能在蛋白質互作網絡中發揮重要的作用，是當歸-菟絲子治療PCOS的關鍵基因。

2.5 GO生物學過程富集分析

利用DAVID數據庫對當歸-菟絲子活性成分對應的潛在靶標進行生物學過程分析，見圖3。P值越小，說明當歸-菟絲子治療PCOS涉及該生物學過程的可能性越大。條形圖中，顏色越紅，P值越小，說明富集越明顯。

2.6 KEGG通路富集分析

再次利用DAVID數據庫對當歸-菟絲子活性成分對應的潛在靶標進行通路分析，見圖4。條形圖中，顏色越紅，P值越小，富集越明顯，說明此通路與治療疾病的關系可能越大。

圖2 當歸-菟絲子治療PCOS可能的關鍵基因Fig.2 Bar graph of the key targets of Angelicae Sinensis Radix-Cuscutae Semen in PCOS

圖3 當歸-菟絲子治療PCOS潛在作用靶標的GO富集Fig.3 GO enrichment of the potential treatment targets of Angelicae Sinensis Radix-Cuscutae Semen

3 討論

PCOS為婦科內分泌常見疾病，中醫常以當歸-菟絲子作為補腎活血藥方之一用于治療PCOS［5］。本研究利用數據庫篩選出當歸-菟絲子中11種有效活性成分，其中研究最多的是槲皮素。有研究［6］表明，與安慰劑組相比，槲皮素可增加PCOS患者血清脂聯素水平，降低血糖、胰島素、膽固醇和甘油三酯水平，降低體內雄激素和黃體生成素水平，改善脂聯素介導的胰島素抵抗和異常的激素水平。在脫氫表雄酮誘導的PCOS小鼠模型中，有學者發現槲皮素可顯著降低小鼠體質量，減小卵巢體積，改善PCOS小鼠的胰島素抵抗狀態，降低肝臟葡萄糖激酶和己糖激酶的特異性活性，明顯增加PCOS小鼠ERα和GLUT4基因表達水平，預示槲皮素可能是治療PCOS胰島素抵抗和不孕的理想化合物［7］。

圖4 當歸-菟絲子治療PCOS潛在作用靶標的KEGG富集通路Fig.4 KEGG pathway analysis of the potential treatment targets of Angelicae Sinensis Radix-Cuscutae Semen

根據靶點預測技術，預測出當歸-菟絲子治療PCOS潛在的作用靶點共135個，利用蛋白相互作用網絡，分析其中可能的關鍵靶標有AKT1、JUN、MAPK1、IL-6和ESR1等。蛋白激酶B即AKT與雄激素之間可形成正反饋，在顆粒黃體細胞增殖和卵泡生長方面具有重要的作用。有研究［8］發現，高雄激素型PCOS患者顆粒黃體細胞中雄激素、AKT1、AKT2的表達增高，說明AKT1和AKT2高表達可能是高雄激素血癥型PCOS患者顆粒黃體細胞功能異常的原因之一。有學者利用基因芯片技術篩選出PCOS差異基因，通過拓撲和功能富集分析，構建轉錄因子-microRNA協同調節網絡，發現轉錄因子SP1與miR-355-5p可能共同作用于靶基因JUN，參與Wnt信號通路、轉化生長因子-β信號通路和細胞周期的調控，在PCOS的發生、發展中發揮重要的作用［9］。MAPK可能參與調節細胞的生長、分化、對環境的應激適應、炎癥反應等多紅細胞生理和病理過程。研究［10］發現，用二甲雙胍和氟他胺治療PCOS小鼠，可上調肝臟和腸管的胰島素信號通路，包括胰島素受體、MAPK1和AKT2等，從而改善PCOS小鼠胰島素抵抗的狀態。IL-6是活化的T細胞和成纖維細胞產生的淋巴因子，IL-6可以調節C反應蛋白轉錄水平，兩者聯合可以預測PCOS患者發生2型糖尿病和心血管疾病的風險［11］。ESR1編碼雌激素受體，可能與雌激素受體2形成同型二聚體或異型二聚體，影響靶組織中的細胞增殖和分化。PCOS患者常因為子宮內膜功能異常，造成生育力降低。有學者發現，來曲唑可增加ESR1的表達，通過Wnt/β-catenin通路，增加子宮內膜厚度，提高PCOS患者的妊娠率［12］。

GO注釋結果顯示，當歸-菟絲子的135個潛在作用靶標主要富集在核受體活性、轉錄因子活性調節序列特異性DNA結合、類固醇激素受體活性、細胞因子受體結合、蛋白質異源二聚體活性、類固醇結合及近端啟動子序列特異性DNA結合等，KEGG的富集通路主要在糖尿病并發癥AGE-RAGE信號通路、液體剪切應力、動脈粥樣硬化和內分泌抵抗等。解釋了PCOS以胰島素抵抗為特征以及遠期易出現2型糖尿病和心血管疾病的可能原因。

綜上所述，本研究表明，當歸-菟絲子治療PCOS的活性成分可能為槲皮素、谷固醇、山柰酚、芝麻素和異鼠李素等11種化合物，這些活性成分可能通過AKT1、MAPK1、IL-6和ESR1等靶標作用于糖尿病并發癥AGE-RAGE信號通路、液體剪切應力、動脈粥樣硬化和內分泌抵抗等信號通路，發揮治療作用。但是，本研究僅在分子水平初步預測當歸-菟絲子治療PCOS可能涉及的信號通路，今后仍需要更多的研究以進一步闡明其作用機制。