鹵烤鴨中類黑精的提取及其抗氧化活性與化學穩定性研究

彭松林，潘成磊，康夢瑤，李懿璇，趙紫悅，鄭仁兵，尚永彪,2,3*

1(西南大學 食品科學學院，重慶，400715)2(農業部農產品貯藏保鮮質量安全評估實驗室(重慶)，重慶，400715)3(重慶市特色食品工程技術研究中心，重慶，400715)4(重慶市鹵制食品工程技術研究中心，重慶，400715)

熟肉制品在貯藏的過程中色澤會衰退，抑制褪色、保持色澤穩定性一直是肉制品加工與貯存中的一道難題[1]。大多數熟肉制品的色澤主要通過發色、美拉德反應等途徑而形成，其中鹵制、燒烤、油炸、高溫殺菌等熱加工中的美拉德反應對肉制品表面的色澤貢獻非常大[2]。鹵烤鴨軟罐頭是經過前處理等工序以及鹵制、烘烤、真空包裝和高溫滅菌產品，產品表面呈黑色稍帶紅色，根據作者的初步研究鴨皮表面的色素物質主要為美拉德反應的產物類黑精，類黑精的變化可能是鹵烤鴨以及同類產品色澤變化的主要原因。研究表明類黑精具有良好的抗氧化活性[3-5]，是一種天然的抗氧化劑，可賦予食品特殊的色澤和風味，且過氧化氫和2,2′-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS)自由基的清除能力和類黑精顏色具有良好的線性關系[6]。此外，類黑精還具有抗突變、抗誘變[7]和降血壓[8]、降血糖[9]等作用。

目前對類黑精的研究主要集中在果蔬和酒類中類黑精提取、抗氧化能力[10-14]和單一定量的美拉德反應模擬體系產物的結構[15-16]等方面，有關鹵烤肉制品中類黑精的提取方法和性質的研究還鮮見報道。本研究目的在于探明肉制品表面主要色素物質之一類黑精的性質特點，為提高肉制品貯藏過程中色澤和風味等感官品質的穩定性提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

個體大小均勻、體態完整、經高壓殺菌真空貯藏的鹵烤鴨，由重慶市某食品生產企業提供；無水乙醇、鐵氰化鉀、抗壞血酸、H2O2、植酸、二氯甲烷(均為分析純)，重慶躍翔化工有限公司；FeCl3、FeSO4、水楊酸(均為分析純)，重慶鈦新化工有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)自由基(分析純)，上海伊卡生物技術有限公司；三氯乙酸(分析純)，成都市科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設備

FA2004A電子天平，上海精天電子儀器有限公司；HH-6數顯恒溫水浴鍋，金壇市富華儀器有限公司；722-P可見分光光度計，上海現科儀器有限公司；LGJ-10真空冷凍干燥機，北京松源華興科技發展有限公司；Avanti J-30I貝克曼冷凍離心機，美國貝克曼庫爾特公司；DW-25 W518冰箱，青島海爾電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鴨皮類黑精提取工藝的優化

1.3.1.1 鴨皮類黑精提取工藝

鴨皮類黑精提取純化工藝如下：

鹵烤鴨開袋→選取鹵烤鴨胸部鴨皮25 g→料理機將鴨皮攪碎→取鴨皮5 g→乙醇溶液提取→提取液經10 000 r/min，10 min離心后取上清液(沉淀蛋白)→二氯甲烷(脫脂)→透析→冷凍干燥→類黑精提取物

參照KANG[17]的方法提純類黑精，將所得類黑精提取液與脫脂劑二氯甲烷以體積比3∶2的比例混合脫脂2次，對脫脂的溶液進行透析，截留分子質量為12 kDa，時間24 h，15 mL提取液通過1 L蒸餾水透析，間隔4～6 h換水，透析所得產物冷凍干燥后即為高分子質量的類黑精，-18 ℃儲存待用。

1.3.1.2 提取劑濃度對提取效果的影響試驗

稱取5.0 g攪碎的鴨皮(鹵烤鴨胸部鴨皮，下同)樣品7組，按料液比1∶20(g∶mL)加入100 mL體積分數為0%、10%、20%、30%、40%、60%、80%乙醇溶液，混勻后在室溫(25 ℃)靜置提取2 h，離心(10 000 r/min，10 min，25 ℃)(下同)，取上清液測定其A420值。以AV值表示鴨皮中提取的類黑精含量(下同)，計算如公式(1)所示，其中，A420值與類黑精含量呈正相關[5, 18]。

類黑精含量(AV值)=A420×V

(1)

式中：A420，420 nm處的吸光值；V，相對體積比倍數。

1.3.1.3 提取料液比對提取效果的影響試驗

稱取5.0 g樣品6組，按照料液比1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50(g∶mL)加入10%乙醇(體積分數)溶液，混勻后室溫靜置，提取2 h，按1.3.1.2離心后測定。

1.3.1.4 提取時間對提取效果的影響試驗

稱取5.0 g樣品8組，按照料液比1∶20(g∶mL)加入10%(體積分數)乙醇溶液，混勻后室溫靜置，在提取0、0.5、1、2、3、4、6、9 h后，按1.3.1.2離心后測定。

1.3.1.5 提取溫度對提取效果的影響試驗

稱取5.0 g樣品7組，按照料液比1∶20(g∶mL)加入10%(體積分數)乙醇溶液，混勻后在20、30、40、50、60、70、80 ℃靜置提取2 h，隨后用純水冷卻到室溫，按1.3.1.2離心后測定。

1.3.1.6 正交試驗設計

為確定鹵烤鴨鴨皮類黑精的最佳提取工藝，依據單因素檢測結果，以類黑精含量(AV值)為檢測指標，以提取劑濃度、提取料液比、提取時間、提取溫度為因子，設計了L9(34)正交試驗，如表1所示。

1.3.2 鹵烤鴨類黑精的抗氧化能力測定

1.3.2.1 樣品處理

將提取純化的類黑精樣品配制成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的溶液備用。

1.3.2.2 類黑精清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)自由基能力測定方法

參照潘牧等[16]的方法有所修改，取各濃度樣品2.0 mL分別加入試管中，在各試管加入2 mL 0.4 mmol/L的DPPH·無水乙醇溶液混勻后，室溫暗處靜置30 min后，在517 nm處測吸光值A1(樣品)；以pH 6.0、0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液代替樣品測吸光值為A0(對照)；以2 mL無水乙醇代替DPPH自由基無水乙醇溶液測定控制組吸光值A2(控制)。DPPH自由基清除率由公式(2)得出：

(2)

式中：A0，空白組吸光值；A1，樣品組吸光值；A2，控制組吸光值。

表1 L9(34)正交試驗因素水平

1.3.2.3 類黑精還原力測定方法

參照王明慧[19]的方法測定有所修改，準確量取樣品1.0 mL于離心管中，分別添加2.0 mL濃度為0.2 mol/L的pH 6.0磷酸緩沖液、2.0 mL濃度為10 g/L的K3Fe(CN)6溶液，混合均勻后靜置，于50 ℃水浴中反應20 min，取出后及時用冷水冷卻，并添加2.0 mL 100 g/L三氯乙酸溶液，充分混合均勻，離心(3 000 r/min，10 min，25 ℃)。取2.0 mL上清液，加入2.0 mL蒸餾水和1.0 mL 1.0 g/L FeCl3溶液，混合均勻后靜置10 min，于700 nm處測定其吸光值A1，以pH 6.0緩沖液代替樣品溶液作空白對照A0，還原力由公式(3)得出:

還原力=A1-A0

(3)

式中：A0，空白組的吸光值；A1，樣品組的吸光值。

1.3.2.4 類黑精·OH清除能力的測定方法

參照DONG等[20]、WANG等[21]的方法，試管中加入1 mL 9 mmol/L FeSO4溶液和2 mL 9 mmol/L水楊酸乙醇溶液，加入2 mL樣品和2 mL 8.8 mmol/L H2O2溶液，室溫靜置1 h后于510 nm處測定吸光值A1，以pH 6.0緩沖液代替樣品作空白A0，不加顯色劑H2O2為A2，·OH清除率由公式(4)得出：

(4)

式中：A0，空白對照吸光值；A1，加樣品吸光值；A2，加樣品不加H2O2吸光值。

1.3.3 類黑精穩定性的影響因素測定

1.3.3.1 樣品處理

將提取純化的類黑精配制成2 mg/mL的溶液。

1.3.3.2 光照(日光)時間對類黑精穩定性的影響試驗

參考張燕等[22]的方法，并作如下修改：取5 mL 2 mg/mL類黑精樣品溶液3組，采用日光照射，光照時間分別為0、6、12 h/d，在放置0、2、4、6、8、10、12 d后測定其A420值。

1.3.3.3 pH對類黑精穩定性的影響試驗

配置4組5 mL 2 mg/mL的類黑精溶液，將pH分別調整為5、6、7、8，避光放置并分別在0、2、4、6、8、10、12 d后測定其A420值。

1.3.3.4 溫度對類黑精穩定性的影響試驗

參考張燕等[22]的方法，并作如下修改：取5 mL 2 mg/mL類黑精溶液，分別在溫度4、25、40 ℃下恒溫放置，避光貯藏放置，于0、2、4、6、8、10、12 d后測定其A420值。

1.3.3.5 還原劑(Na2SO3)對類黑精穩定性的影響試驗

參考趙一夢等[13]的方法，并作如下修改：取2 mL 2 mg/mL類黑精樣品溶液3組，分別加入等體積濃度為0%、0.05%、0.1% Na2SO3溶液，避光貯藏放置，分別反應0、2、4、6、8、10、12 d后測定其A420值。

1.3.4 數據統計與分析

本試驗共重復3次，每次試驗重復樣設3個，取均值，通過正交設計助手V 3.1設計正交、Excel 2016處理數據、SPSS 20.0分析顯著性 (P<0.05)、Origin 2018作圖。

2 結果與分析

2.1 鹵烤鴨類黑精提取工藝單因素及正交試驗結果

2.1.1 提取劑濃度

溶劑提取法是類黑精提取的常用的方法，提取劑一般為水或不同濃度的乙醇溶液，不同溶液濃度對提取效果也有較大影響[23]。由圖1可知，當提取劑為純水時，效果最好，鴨皮類黑精提取量為13.85，乙醇體積分數為10%時提取量為13.62，兩者差異不顯著(P>0.05)，隨著乙醇體積分數的增加，鹵烤鴨類黑精提取量逐漸降低(P<0.05)。王明慧[19]發現乙醇體積分數10%時，糯米藕中類黑精提取效果最好，且與純水提取效果無明顯差距(P>0.05)，與本試驗結果基本一致；KIM等[3]指出適當添加乙醇可以提高類黑精在水溶液中的穩定性。因此，試驗以體積分數為0%～10%的乙醇溶液為提取溶劑。

圖1 乙醇體積分數對鴨皮類黑精提取量的影響

2.1.2 提取料液比

由圖2可知，隨著料液比的改變，提取出類黑精的量先增加后減少(P<0.05)。當料液比為1∶5時，鹵烤鴨類黑精的提取效果最差，當料液比從1∶10增至1∶40時，提取量顯著增加(P<0.05)，在1∶40時提取出類黑精的量最大，當料液比為1∶50時，提取量降至12.19。原因可能是料液比的提高，使提取劑量變大，加快了溶劑擴散率和傳質速率，有助于類黑精的提取，而當料液比繼續升高至1∶50，溶劑量過大致使提取效率下降，提取時間會有所延長，且長時間的浸泡，鴨皮中的雜質溶解增多，會阻礙類黑精的溶解。李娜等[24]、于修燭等[25]在優化提取工藝時也有類似發現。因此，在料液比為1∶40(g∶mL)時，類黑精有最大提取量。

圖2 料液比對鴨皮類黑精提取量的影響

2.1.3 提取時間

由圖3可知，提取0.5、1 h類黑精的提取量分別為10.85、11.01，差異不顯著(P>0.05)，當時間延長至 2、3 h時，提取量上升到13.66、13.93，提取時間在4 h時，類黑精提取量有最大值16.55，提取時間為6、9 h時，提取量有所降低，為14.57、12.88。綜上，隨著提取時間的延長，提取量先升高后下降，有顯著差異(P<0.05)。原因可能是隨著提取時間的延長，提取劑溶解雜質的含量增加，使得類黑精提取出的含量降低[26]，李娜等[24]認為長時間提取使乙醇溶劑揮發而造成溶劑量減少，也會使類黑精的提取率下降。因此，在提取時間為4 h時，類黑精有最大提取量。

圖3 提取時間對鴨皮類黑精提取量的影響

2.1.4 提取溫度

如圖4所示，隨著提取溫度的提高，鴨皮類黑精提取量先升后降(P<0.05)。在25 ℃時，類黑精提取量僅為4.96，效果最差，在40 ℃時，提取效果顯著增強(P<0.05)，當溫度升高到50 ℃，提取量有最大值14.47(P<0.05)，當溫度繼續提升至60、70、80 ℃時，類黑精的提取量逐漸降低(P<0.05)。原因可能是在25～50 ℃，隨著溫度升高，提高了產物的溶解度和擴散速度，促使提取效率提高[27]，而當溫度繼續升高時，易造成破壞類黑精的原有結構，導致其分解、轉換或揮發散失[19]。因此，類黑精提取量在提取溫度為50 ℃時達到最大。

圖4 提取溫度對鴨皮類黑精提取量的影響

2.1.5 正交試驗結果

基于單因素試驗，進行L9(34)正交試驗，試驗結果如表2、3所示。在所測范圍內，提取劑濃度、提取溫度對提取效果影響顯著(P<0.05)，其影響強弱順序為：A>D>C>B；最佳組合為：A2B2C2D3，即體積分數5%的乙醇溶液、料液比為1∶40、提取時間4 h、提取溫度60 ℃，按該提取條件進行驗證，測得類黑精提取量為19.13，結果高于正交表中任意組合，說明在該組合條件下提取效果最佳。

表2 正交試驗結果

表3 方差分析結果

2.2 鹵烤鴨鴨皮類黑精的抗氧化能力

2.2.1 鹵烤鴨鴨皮類黑精的DPPH自由基清除能力

DPPH自由基常被用來評價抗氧化劑對自由基的清除能力[28]。如圖5所示，鴨皮類黑精具有一定的DPPH自由基清除能力且與濃度呈現劑量依賴關系，在0.2～1.0 mg/mL質量濃度范圍內，DPPH自由基清除能力隨著濃度的升高顯著增強(P<0.05)；當濃度為1.0 mg/mL時，DPPH自由基清除能力為55.30%。但與同濃度抗壞血酸(VC)95.81%的DPPH自由基清除能力差距較大。綜上，鴨皮類黑精有一定的DPPH自由基清除能力。

圖5 不同濃度鴨皮類黑精的 DPPH·清除能力

2.2.2 鹵烤鴨鴨皮類黑精的還原能力

總還原力是評價抗氧化活性的常用指標，有抗氧化性的物質會提供電子供體，將Fe3+還原成 Fe2+，阻止自由基鏈式反應[29]。由圖6可知，當類黑精質量濃度為0.2 mg/mL時，還原力為0.089；當質量濃度增加至0.4、0.6、0.8 mg/mL時，還原力隨之增大至0.156、0.226、0.287；當質量濃度增至1.0 mg/mL時，還原力達到最大值0.355，樣品濃度不同，還原力差異顯著(P<0.05)。但均顯著低于同濃度抗壞血酸的還原力(P<0.05)。因此，鴨皮的類黑精有一定的還原力，并隨濃度的增加顯著增加(P<0.05)。

圖6 不同濃度鴨皮類黑精還原能力

2.2.3 鹵烤鴨鴨皮類黑精的·OH清除能力

·OH清除能力也是反映抗氧化活性的重要指標，水楊酸法通過加入具有抗氧化性的樣品消耗Fenton反應生成·OH，減少2,3-二羥基苯甲酸的生成。由圖7可知，隨著鴨皮類黑精的濃度的增加，·OH清除能力顯著增強(P<0.05)。當質量濃度為0.2、0.4 mg/mL時，其·OH清除能力為3.84%、5.26%，當質量濃度增加至1.0 mg/mL，·OH清除能力顯著增強(P<0.05)，為22.65%。但與常見的抗氧化物質抗壞血酸的·OH清除能力差距較大(P<0.05)。綜上，鴨皮類黑精具有一定的·OH清除能力，并隨濃度得增大而增強。

圖7 不同濃度鴨皮類黑精的·OH清除能力

2.3 鹵烤鴨類黑精在貯藏過程中的變化

類黑精是Maillard反應產生的一類深褐色高分聚合物，其含量的減少與鹵烤鴨色澤衰退有關系密切。KIM等[3]、BEKEDAM[30]均表示類黑精含量與吸光度成正比，420 nm處的吸光度常用來表示類黑精含量。由圖8可知，隨著貯藏時間的延長，鹵烤鴨鴨皮中類黑精吸光度A420先增加后減小(P<0.05)。鴨皮類黑精的A420初始值為0.440，類黑精的A420增加至0.495，這一結果與鹵烤鴨貯藏0～2個月黑褐色加深的實際相符，原因可能是在貯藏過程中Maillard反應繼續進行，有新的類黑精生成。貯藏2個月時，類黑精的A420減小至0.423，與初始值差異不顯著(P>0.05)，貯藏時間超過3個月后，類黑精的吸光度A420繼續減小，貯藏時間延長至6個月時，類黑精的A420值減至最小值0.307。該試驗結果與鹵烤鴨的色澤貯藏初期有所加深，2～3個月后色澤明顯劣變為棕黃色的實際相符。以上說明類黑精含量的降低是鹵烤鴨色澤劣變存在一定相關性，提高鴨皮類黑精在貯藏過程中的穩定性有利于穩定其特有的黑褐色[31]。

圖8 貯藏過程中類黑精含量的變化

2.4 鹵烤鴨類黑精的穩定性研究

2.4.1 日光光照時間

由圖9可知，隨著放置時間的延長， 3個組別類黑精的吸光度均逐漸較小。初始時，無光照、6 h/d光照、12 h/d光照類黑精的吸光度分別為0.408、0.405、0.405，無明顯差異(P>0.05)；放置2 d后無光照處理組與6 h/d光照、12 h/d光照處理組差異顯著(P<0.05)；放置3 d后3個試驗組之間有明顯差異(P<0.05)，隨著時間的延長，差異繼續增大；放置時間延長至12 d后，無光照、6 h/d光照、12 h/d光照3個試驗組類黑精的吸光度分別下降12.25%、29.24%、38.65%，下降幅度依次是12 h/d光照組>6 h/d光照組>無光照組。由此說明，日光對類黑精的穩定性有不利影響，且隨著光照時間的延長，對類黑精的結構的破壞程度增強。此結果與趙一夢等[13]研究結果基本一致。因此，為延緩色澤劣變，鹵烤鴨在流通、貯藏過程中應注意避光。

圖9 光照對類黑精穩定性的影響

2.4.2 pH

由圖10可知，隨著放置時間的延長，pH 5、pH 6、pH 7試驗3個試驗組的類黑精的吸光度均呈逐漸減小的趨勢，減小的幅度依次是pH 5>pH 6>pH 7，pH值為8的試驗組吸光度穩定在0.39～0.41，變化較小。放置0～2 d時間內，4個pH試驗組類黑精的吸光度差異不顯著(P>0.05)，放置時間4～8 d內，pH值為5的試驗組類黑精的吸光度與其他3個試驗組出現顯著差異(P<0.05)，放置時間延長至12 d時，4個pH試驗組之間的類黑精吸光度差異顯著(P<0.05)。由此說明，pH值對鴨皮類黑精的穩定性有一定影響，且穩定性順序為pH 8>pH 7>pH 6>pH 5。時川[11]研究黑變紅棗棗皮類黑精穩定性時，發現類黑精在中性及弱堿性條件下比較穩定，與本試驗結果相同。

圖10 pH對類黑精穩定性的影響

2.4.3 溫度

如圖11所示，隨著放置時間的延長，4、25、40 ℃ 3個試驗組類黑精的吸光度均呈現逐漸減小的趨勢，25、40 ℃試驗組降幅較大，4 ℃試驗組降幅較小。初始時，4、25、40 ℃試驗組的體系吸光度均在0.401左右，差異不大(P>0.05)；0～4 d內，各試驗組的吸光度具有小幅降低，但各組之間未出現明顯差異(P>0.05)；6 d后，各組吸光度逐漸增大；直至12 d時，4、25、40 ℃試驗組類黑精的吸光度分別降低了2.8%、11.45%、22.08%，各組之間差異明顯(P<0.05)。由此表明，溫度對鹵烤鴨鴨皮類黑精的穩定性有一定影響，低溫有利于提高類黑精的穩定性，原因可能是低溫抑制了鴨皮中類黑精的氧化降解。因此，降低貯藏溫度對延緩鹵烤鴨產品色澤劣變有一定延緩作用。

圖11 溫度對類黑精穩定性的影響

2.4.4 還原劑(Na2SO3)

如圖12所示，隨著放置時間的延長，3個組別類黑精吸光度均呈現逐漸減小的趨勢。初始時，3個還原劑試驗組的體系吸光度均在0.317左右，差異不大(P>0.05)；0～2 d，雖有小幅降低，但未出現明顯差異(P>0.05)；3～6 d，0.05%、0.10% Na2SO3兩個還原劑試驗組之間差異不明顯(P>0.05)，但與對照組有明顯差異(P<0.05)，直至6 d，0.00%、0.05%、0.10% Na2SO3三個還原劑試驗組類黑精吸光度分別降至0.272、0.282、0.288。由此說明，添加還原劑(Na2SO3)可以提高對鴨皮中類黑精的穩定性。

圖12 還原劑(Na2SO3)對類黑精穩定性的影響

3 結論

本研究發現，鹵烤鴨中類黑精提取的最佳參數為：提取溶劑為5%(體積分數)乙醇、料液比為1∶40(g∶mL)、提取時間4 h、提取溫度60 ℃。經過測定，發現鴨皮類黑精具有較強DPPH自由基清除能力，一定的還原力及·OH清除能力，且與濃度顯著正相關，但其抗氧化能力弱于VC。隨著貯藏時間的增加，鹵烤鴨鴨皮中的類黑精含量呈現先升高后降低的趨勢，且在貯藏1個月后達到最大值。光照時間(日光)、溫度、pH、還原劑(Na2SO3)對鹵烤鴨鴨皮中類黑精的穩定性均有一定影響，為提高類黑精的穩定性，延緩色澤劣變，應避免日光照射、降低貯藏溫度、調節pH至中性或弱堿性以及適當添加還原劑。

鹵烤鴨中的類黑精在鹵烤過程產生，可賦予其良好色澤與風味，具有一定的抗氧化活性，外部條件對類黑精穩定性有一定影響，其含量的變化與鹵烤鴨色澤的改變關系密切。本研究為探究熟肉制品類黑精的提取工藝與應用提供了理論依據和技術方法。關于鹵烤鴨類黑精的結構與其他活性，有待于進一步研究。