復配精油納米乳霧化處理對馬鈴薯發芽的抑制作用及機理探討

李子和，夏泆斌，張忠，畢陽，喬彩紅，李斌山，WILLIAM OYOM

(甘肅農業大學 食品科學與工程學院， 甘肅 蘭州，730000)

馬鈴薯作為全球四大糧食作物之一，其在貯藏期間會進入休眠狀態。休眠是植物通過進入生長暫停狀態來應對外界脅迫的一種生理反應[1]。當馬鈴薯的休眠被打破時其芽就會萌發。傳統控制馬鈴薯在貯藏期間發芽的主要方法是使用化學抑制劑。氯苯胺靈(3-chlorophenyl carbamicacid，CIPC)是馬鈴薯貯藏中最有效的芽抑制劑，已經使用了40多年[2]。然而，大量濫用包括CIPC在內的合成化學抑制劑會對環境造成許多問題，并影響到其他生物[3]。因此人們對尋找新的安全高效的馬鈴薯發芽抑制劑越來越感興趣。植物精油已被證明可以抑制馬鈴薯塊莖的發芽。薄荷精油可以抑制不同品種馬鈴薯塊莖的發芽[4]，并較CIPC處理能夠使馬鈴薯塊莖保有更高的水分，降低塊莖的失重率[5]；薄荷精油的主要成分薄荷醇，已被研制為有效的馬鈴薯發芽抑制劑[6]；添加迷迭香精油還更多保留了馬鈴薯塊莖中的抗壞血酸和總多酚，從而維持了其抗氧化活性[7]；香茅精油可以抑制馬鈴薯的發芽，讓其在10 ℃以下存放60 d而不發芽[8]。

直接使用精油來抑制馬鈴薯發芽需要較高劑量才能達到預期效果，這會導致塊莖感官品質降低，增加塊莖處理成本。精油具有不穩定性、高疏水性和揮發性等特點。因此，許多研究對于精油在微膠囊、微球、納米乳、脂質體等多種分散體系中的包合性進行了評價，旨在提高精油的分散性，通過緩釋降低揮發損失，提高其生物效能[9]。崔婷的研究發現以白芨多糖作為壁材包埋的桂花精油保持了原有的抗氧化活性并與壁材產生協同作用[10]；任婧楠等發現使用甜橙精油制成的納米乳液對于多種細菌具有良好的抑制作用[11]。活性氧代謝是控制馬鈴薯塊莖休眠與發芽的一個重要因素。

“隴薯7號”馬鈴薯塊莖是晚熟品種，其休眠期長達4個月[22]，出于控制實驗周期的目的，我們選用貯藏在10 ℃條件下120 d的“隴薯7號”商品薯[23]進行實驗。為了控制精油抑芽處理的成本，本試驗將4種傘形科植物精油進行復配制備出復配精油納米乳，并選用霧化的方式對馬鈴薯塊莖進行處理，探究復配精油納米乳(mixed essential oil nanoemulsion,MEON)處理對馬鈴薯塊莖抑芽的影響，從氧化抗氧化內穩態平衡維持的角度探討其抑制發芽的機理，對馬鈴薯塊莖的發芽率、失重率、H2O2含量進行測定，并對關鍵抗氧化物質和酶活的變化進行了評價，找到一種新的天然馬鈴薯塊莖抑芽劑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

4種傘形科植物種子孜然(CuminumcyminumL.)、芫荽(CoriandrumsativumL.)、葛縷子(Carumcarvi)和蒔蘿(AnethumgraveolensL.)分別產自甘肅省酒泉市玉門飲馬農場、甘肅省酒泉市玉門飲馬農場、山東省山東省萊蕪市金簍種植專業合作社和山東省萊蕪市正香園香辛料種植專業合作社。

供試馬鈴薯‘隴薯7號’由甘肅省定西市愛蘭馬鈴薯種業有限責任公司香泉基地提供，采收當天運回實驗室，4 ℃冷庫貯藏至第二年春季實驗待用。

1.2 方法

1.2.1 精油的提取及復配

采用水蒸餾法提取精油。將不同原料分別用高效植物樣品粉碎機粉碎。物料粉與蒸餾水按1∶10的料液比加入，蒸餾3 h停止加熱。油水分離收集精油并用無水硫酸鈉干燥，4 ℃保存。復配精油按照本實驗室的方法分別用孜然精油58.3%、芫荽精油14.1%、蒔蘿精油23.7%、葛縷子精油3.9%進行復配。

1.2.2 超聲波法制備復配精油納米乳

在室溫下，用去離子水制備不同質量分數的Tween80，將Tween80與復配精油以8∶1的比例混合，在45 ℃下用磁力攪拌器以2 000 r/min混合2 min至均勻，形成粗乳液。使用超聲波細胞破碎儀對粗乳進行20 min的超聲均質。在均質過程中，將乳劑置于冰中，防止超聲過熱破壞乳液。

1.2.3 復配精油納米乳對馬鈴薯塊莖的霧化處理

參照李永才等[24]的方法并稍作修改進行發芽實驗。選取4 ℃條件下貯藏4個月待用的“隴薯7號”馬鈴薯塊莖，在10 g/L的次氯酸鈉溶液中浸泡5 min進行消毒，無菌水沖洗3次，晾干。處理組用3.5、7 μL/mL的納米乳霧化處理10 min，對照組用無菌水霧化處理10 min。每組處理12個塊莖，實驗重復3次。將處理好的馬鈴薯放置在適宜的發芽條件下(溫度20 ℃,避光，相對濕度90%)[12,25]進行貯藏，于第10天觀察其發芽情況，具有至少一個長于3 mm的芽的塊莖被認為是發芽馬鈴薯塊莖。

測定指標：

(1) 發芽率的測定：按芽眼數計算，如公式(1)所示：

(1)

(2) 失重率的測定：采用差量法，如公式(2)所示：

(2)

1.2.4 馬鈴薯芽眼部位取樣

選擇健康、新鮮的馬鈴薯塊莖，在1%的次氯酸鈉溶液中浸泡5 min進行消毒，無菌水沖洗3次，晾干，12個為一組放置在10 L的密閉保鮮盒中。處理組在室溫下用3.5、7 μL/mL納米乳熏蒸處理10 min，對照組用無菌水熏蒸處理10 min。每個處理組12個塊莖，實驗重復3次。于處理后第0天、第3天、第6天和第9天取馬鈴薯芽眼部位組織3 g。用錫箔紙包裝后液氮冷凍并在-80 ℃貯藏待用。

1.2.5 芽眼部位H2O2含量的測定

H2O2含量的測定參考PROCHAZKOVA等[26]的方法并修改。H2O2含量的測定是通過鈦-過氧化氫絡合物的形成進行評估的。將2 g塊莖組織粉末與預冷丙酮混勻，提取10 min，在4 ℃，8 000×g條件下離心30 min。取出1 mL的上清液，先后加入100 μL 20% TiCl4(溶于體積分數37%濃HCl)和100 μL濃氨水，均質10 min，繼續離心10 min，保留沉淀，將沉淀用預冷丙酮洗滌3次，最后用2.0 mL 1 mmol/L H2SO4溶液進行溶解，在410 nm處測定溶液的OD值。通過標準曲線計算出H2O2的含量，以mmol/g表示。

1.2.6 關鍵抗氧化相關酶活的測定

SOD活性的測定參考PROCHAZKOVA等[26]的方法并改進。取2 g塊莖組織粉末于50 mmol/L磷酸緩沖液中提取10 min，在4 ℃條件下，8 000×g離心30 min，取上清液用于SOD活性的測定。酶活測定體系包括：1.5 mL 50 mmol/L磷酸緩沖溶液(pH 7.8)，200 μL 100 mmol/L的蛋氨酸，100 μmol/L EDTA-Na2，750 μmol/L的氮藍四唑，200 μL的粗酶液，100 μL的核黃素。對照以緩沖溶液代替酶液，在15 000 lx日光燈下反應結束后于560 nm處分別測定吸光度值。以每克鮮重抑制氮藍四唑光化還原的50%為一個酶活性單位來表示SOD的活性。

CAT活性的測定參考FAN等[27]方法并修改。取2 g塊莖組織粉末，加入5 mL 0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH 7.5，含有5 mmol/L二硫蘇糖醇和20 g/L PVPP)，振蕩混勻，冰浴條件浸提10 min，于4 ℃、8 000×g的條件下離心30 min，取上清液測定CAT活性。酶活反應體系包括：2 mL 10 mmol/L H2O2(用50 mmol/L pH 7.5的磷酸緩沖液配制)和100 μL粗酶液。在240 nm處測定反應體系120 s內的吸光值變化。CAT活性以U/g FW來表示。

PPO活性的測定參照NETSANET等[28]的方法并改進。反應體系由2 mL 50 mmol/L的醋酸緩沖溶液(pH 5.5)、200 μL酶液和0.6 mL 1 mol/L鄰苯二酚溶液組成。從加入酶液啟動反應1 min后，開始記錄每秒鐘反應體系在420 nm的吸光度值，連續測定2 min。以每分鐘ΔOD420為一個酶活單位U，即PPO酶活性表示為U/g FW。

POD活性的測定參照TEREFE等[28]的方法并改進。反應體系由2.6 mL 25 mmol/L愈創木酚溶液[用50 mmol/L醋酸緩沖液(pH5.5)配制]、0.2 mL 250 mmol/L H2O2溶液和0.4 mL酶液組成。加酶液啟動反應后1 min開始記錄每秒鐘反應體系在470 nm的吸光度值，連續測定2 min。以每分鐘ΔOD470為一個酶活單位U，即POD酶活性表示為U/g FW。

1.2.7 關鍵抗氧化物質的測定

氧化型谷胱甘肽(glutathione disulfide，GSSG)含量的測定參照王立梅等[29]的方法進行，氧化型谷胱甘肽(glutathione disulfide，GSSG)含量采用試劑盒2-VP法測量，GSSG的含量表示為μmol/g FW。

還原性谷胱甘肽(reduced glutathione，GSH)含量的測定參照王立梅等[29]的方法進行，通過[5,5′-Dithiobis(2-nitrobenzoic acid)，DTNB]與GSH反應生成復合物，在412 nm處有特征吸收峰；其吸光度與GSH含量成正比，采用相應試劑盒測量，GSH的含量表示為μmol/g FW。

還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)的含量參考LIU等[12]的方法使用試劑盒進行測定，NADPH在堿性條件下穩定，0.1 mol/L HCl和0.1 mol/L NaOH可將煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADP)和NADPH分開。NADP可被6-磷酸葡萄糖脫氫酶還原為NADPH，NADPH通過吩嗪硫酸甲酯的遞氫作用，使氧化型噻唑藍還原為甲臜，高濃度的NaCl可使酶反應終止，并使甲臜沉淀下來，加入體積分數96%乙醇使之溶解，顯紫色，570 nm下檢測吸光值，吸光值的高低與NADP和NADPH的含量高低成正比，NADPH的含量表示為mol/g FW。

總酚含量的測定根據ISABEL等[30]的方法稍作修改，在室溫下，將100 mg樣品溶于1 mL含1%(體積分數)HCl的80%(體積分數)甲醇溶液，在設定為200 r/min的軌道搖床上萃取2 h。以1 000×g離心15 min,收集上清液用于酚類測定。酚類物質的測定：取100 μL提取液到5 mL容量瓶中與0.75 mL FolinCiocalteu試劑(之前用蒸餾水稀釋10倍)混合，在22 ℃下靜置5 min后；向混合物中加入0.75 mL Na2CO3溶液(60 g/L)，在22 ℃ 90 min后于725 nm處測定吸光值，制定沒食子酸標準曲線評估總酚含量，表示為mg/100mg FW。

總黃酮含量的測定參考鐘秋平等[31]的方法并稍作修改，將100 mg樣品溶于1 mL含1%體積分數HCl的80%體積分數甲醇溶液，在設定為200 r/min的軌道搖床上萃取2 h。以1 000×g離心15 min,收集上清液用于總黃酮測定。總黃酮類物質測定：取0.5 mL提取液至10 mL離心管，加入0.2 mL 50 g/L NaNO2溶液，搖勻，常溫下反應6 min，加入0.2 mL 100 g/L Al(NO3)3溶液，常溫下反應6 min，加入40 g/L NaOH溶液2 mL，常溫下反應15 min，蒸餾水定容至5 mL。以乙醇為對照，測定在510 nm處的OD值,表示為mg/100mg FW。

1.2.8 數據統計

本實驗采用Origin 2017和SPSS 19.0統計分析軟件進行數據統計處理并作圖。

2 結果與分析

2.1 復配精油納米乳熏蒸抑制馬鈴薯發芽

不同濃度的復配精油納米乳處理馬鈴薯，馬鈴薯的發芽率有明顯變化而失重率沒有顯著變化。可見復配精油納米乳處理可以抑制馬鈴薯的發芽，并且塊莖對復配精油納米乳有濃度依賴性，當濃度為3.5 μL/mL和7.0 μL/mL時發芽率為37.7%和26.6%，相比對照組發芽率53.3%有明顯降低，表明馬鈴薯塊莖對復配精油納米乳具有濃度依賴性且不同濃度的復配精油納米乳對于抑制馬鈴薯塊莖發芽都具有抑制作用(圖1)。

a-失重率；b-發芽率

2.2 復配精油納米乳霧化降低了馬鈴薯芽眼部位的H2O2含量

復配精油納米乳處理的馬鈴薯塊莖芽眼部位H2O2含量有明顯的變化。對照組和處理組呈現出先下降后上升的趨勢，在0 d時對照組和處理組沒有顯著差異，在3 d時3.5 μL/mL復配精油納米乳處理的H2O2含量是對照組2.07倍，7.0 μL/mL復配精油納米乳處理的H2O2含量事對照組的2.96倍，而在9 d時2個處理組的H2O2含量分別低于對照組19%和31.7%。MOHAMMED等[14]發現H2O2的提高能夠縮短休眠時間，馬鈴薯休眠時H2O2含量會有短暫顯著的增加，促進馬鈴薯發芽，本實驗中處理組的H2O2含量明顯低于對照組的H2O2含量，這會有助于延長馬鈴薯塊莖的休眠時間且抑制馬鈴薯塊莖的發芽(圖2)。

圖2 納米乳霧化改變馬鈴薯芽眼部位的H2O2含量

2.3 復配精油納米乳霧化改變了馬鈴薯芽眼部位關鍵抗氧化酶活性

SOD的活性呈現先下降后上升的趨勢，7.0 μL/mL復配精油納米乳處理能夠減緩SOD活性的降低。在3 d時2種濃度的復配精油納米乳處理的SOD活性都明顯高于對照組；在6 d時7.0 μL/mL復配精油納米乳處理組的SOD活性最高，是對照組的1.42倍。6 d后對照組和處理組皆有下降趨勢。BAKER等[15]發現SOD作為一種活性氧清除酶對于活性氧的積累具有抑制作用，而在本實驗中觀察到6 d時高濃度處理組的SOD活性與對照組相比有明顯的提高，說明SOD活性的升高對塊莖的發芽有抑制作用(圖3)。

CAT的活性表現出先下降后上升再下降的趨勢。在6 d時處理組與對照組的CAT活性差異達到最大，3.5 μL/mL和7.0 μL/mL復配精油納米乳處理的CAT活性分表高于對照組16.5%和58.3%。MOHAMMED等[14]研究發現抑制CAT的活性可以減緩馬鈴薯的休眠打破，延緩馬鈴薯芽的生長，這與本實驗所得到的結果一致，可以說明CAT活性的抑制延長了馬鈴薯塊莖的休眠時間從而抑制了馬鈴薯塊莖的發芽(圖3)。

POD的活性呈現先上升再下降的趨勢。在前3 d，復配精油納米乳處理組和對照組的POD活性都有所升高；在3 d時復配精油納米乳處理組和對照組的POD活性都達到峰值，7.0 μL/mL復配精油納米乳處理組的POD活性高于對照組23.1%。GRAHAM等[16]認為POD作為一類氧化還原酶具有清除H2O2的能力，本實驗則發現高濃度處理組的POD活性要高于低濃度處理組和對照組的POD活性，結果與預期一致，說明POD抑制了H2O2積累，減緩了ROS積累以抑制馬鈴薯塊莖的發芽(圖3)。

塊莖的PPO活性整體呈現上升的趨勢。從3 d開始7.0 μL/mL的復配精油納米乳處理組的PPO活性在3 d、6 d、9 d時分別高于對照組24.3%、29.5%、29.5%。SOLOMON等[17]認為PPO是一種含銅金屬酶，其催化酚依賴于氧的氧化形成醌，其與氧分子的結合密切相關，并通過芬頓反應產生ROS。本實驗發現在馬鈴薯塊莖的發芽過程中高濃度處理組的PPO活性高于低濃度處理組和對照組的PPO活性，可以說明PPO活性的提高與ROS的生成為負相關的關系，進一步說明PPO活性的提高抑制了馬鈴薯塊莖的發芽(圖3)。

a-SOD活性；b-CAT活性；c-POD活性；d-PPO活性

2.4 復配精油納米乳提高了馬鈴薯塊莖的NADPH含量

NADPH的含量表現為先下降后上升的趨勢，在前3 d復配精油納米乳處理的馬鈴薯的NADPH含量與對照組無明顯差異，在6 d時3.5 μL/mL和7.0 μL/mL的復配精油納米乳處理組NADPH含量分別高于對照組10%和15.2%。并且在9 d時對照組和7.0 μL/mL處理組的NADPH的含量到達整個貯藏期的峰值，且7.0 μL/mL處理組的NADPH高于對照組16.4%。莘冰茹[21]提出NADPH是一種極為重要的核苷酸類輔酶，其作為供氫體為維持還原型谷胱甘肽穩定有著重要作用，并且還在維持硫氧還蛋白系統的活性，參與細胞轉導和抗氧化防御中充當重要的角色，本實驗測得高濃度處理組的NADPH含量在6 d開始明顯高于對照組，這可能有助于GSH狀態的穩定。GSH屬于細胞壁的次生代謝產物，其具有使ROS失活的作用[12]，所以此實驗結果證明NADPH含量的上升有助于抑制馬鈴薯塊莖的發芽(圖4)。

圖4 納米乳霧化干預芽眼部位的NADPH含量

2.5 復配精油納米乳降低了馬鈴薯總酚和總黃酮的含量

復配精油納米乳處理對馬鈴薯塊莖的總酚和總黃酮含量有明顯抑制。整個貯藏期間對照組總酚的含量呈現先上升在下降的趨勢，并且在6 d時到達峰值，對照組總酚含量高于3.5 μL/mL處理組58.2%，高于7.0 μL/mL處理組30.2%。總黃酮的含量隨時間延長呈現先降低后升高的趨勢，在3 d時出現最低值，7.0 μL/mL處理組的總黃酮含量是對照組的43%。LIU等[12]認為總酚和總黃酮都屬于細胞壁的次生代謝產物，其性質類似于GSH，由本實驗得到的結果可以發現總酚和總黃酮在處理組馬鈴薯塊莖中的含量低于對照組馬鈴薯塊莖，證明了總酚和總黃酮含量的降低對于馬鈴薯塊莖發芽的抑制有正向作用(圖5)。

a-總酚含量；b-總黃酮含量

2.6 復配精油納米乳提高了還原型谷胱甘肽的含量

GSH的含量在整個貯藏期呈現先上升后穩定的態勢，并在3 d時到達峰值，其中3.5 μL/mL復配精油納米乳處理組的GSH是對照組的1.77倍。復配精油納米乳處理對于GSSG含量的影響整體呈現下降態勢，從第3天開始可以看出2個濃度處理組與對照組的GSSG含量存在顯著差異，并且6 d后處理組的GSSG含量開始明顯低于對照組。這與上文中NADPH含量的實驗以及LIU等[12]的研究結果基本一致，說明GSH含量上升抑制了ROS的生成，進一步抑制了馬鈴薯塊莖的發芽(圖6)。

a-GSH含量；b-GSSG含量

3 結論

精油對于馬鈴薯塊莖的抑芽作用已經得到證明，但是精油使用的高成本、感官差、時效短等缺點還未得到有效解決，本實驗采用4種傘形科植物孜然、芫荽、葛縷子和蒔蘿的精油制備出的復配精油納米乳相較于精油具有更好的抑芽作用，采用霧化處理的方式有效提高了精油的利用率且降低了成本，但是對于氣味的影響尚無有效的應對措施。4種傘形科植物孜然、芫荽、葛縷子和蒔蘿的精油制備出的復配精油納米乳具有較強的抑芽活性，能顯著抑制馬鈴薯的發芽，其機理可能是通過提高NADPH含量使細胞有充足的還原力，讓GSH在馬鈴薯塊莖的發芽過程中保持穩定，并抑制了總酚和總黃酮含量來抑制ROS的活性；同時提高SOD、CAT、PPO和POD等關鍵抗氧化酶的活性，降低H2O2的含量，消除馬鈴薯塊莖中的ROS，來延長馬鈴薯塊莖的休眠時間，并使馬鈴薯芽的萌發受到抑制。但對于復配精油納米乳抑制馬鈴薯塊莖發芽的作用位點以及作用方式，還待進一步研究。