NaCl對添加絲氨酸蛋白酶的肌原纖維蛋白凝膠特性的影響

陸益鋇，呂春霞，廖慧琦，胡遠輝，雷葉斯，曹少謙，楊華

(浙江萬里學院 生物與環境學院，浙江 寧波，315100)

魚肉中普遍含有絲氨酸蛋白酶，該酶可以引起肌原纖維蛋白降解，導致魚糜凝膠發生凝膠劣化現象[1]。研究發現，絲氨酸蛋白酶大部分位于肌原纖維部位，少量位于肌漿部分，絲氨酸蛋白酶可以與肌原纖維蛋白緊密結合、難以分離，并具有強活性[2-6]。OSATOMI等[7]首次用高鹽溶液酸處理分離純化鯉魚肉中的絲氨酸蛋白酶。部分學者在狗母魚[5]、鰱魚[3]、鯽魚[8]等中相繼發現并分離出絲氨酸蛋白酶。研究發現，55 ℃下，將純化后的絲氨酸蛋白酶添加到鯉魚肌原纖維中，反應1 h后，肌動蛋白被降解成不同的片段，而肌球蛋白重鏈、α-輔肌動蛋白幾乎完全被降解了。相同條件下，蛇鯔的肌球蛋白重鏈同樣被降解了，但其他蛋白幾乎不變，故絲氨酸蛋白酶參與凝膠劣化現象，但不同的物種具有差異[2]。為了抑制內源性絲氨酸蛋白酶的活性，添加抑制劑是一種較為有效的手段。

在魚糜制品生產過程中，為了保證魚糜制品具有良好的風味、口感及凝膠性能，經常會添加一些外源添加劑。魚肉加工中經常會添加一些食鹽，首要目的是調節魚肉制品的味道，還可以使鹽溶性蛋白溶解，提高魚糜制品的凝膠特性。文獻表明NaCl對肌原纖維蛋白凝膠性能起著重要的作用，可以改變環境中的離子強度，提高肌原纖維蛋白的溶解性，在加熱過程中，肌原纖維蛋白發生變性，將水分包裹在內，提高肌原纖維蛋白凝膠的持水性，改善魚糜的質構特性[9]。有研究發現，離子強度會影響蛋白凝膠的微觀結構，在低離子強度下(0.2～0.4 mol/L NaCl)，形成較細的鏈狀結構，在高離子強度下則形成粗絲狀的網絡結構[10-11]。且NaCl具有較強的防腐功能，可以抑制一些腐敗菌的生長繁殖，延長食品的保質期[12-13]。有研究證實，在肌原纖維蛋白中添加NaCl，可以引起其膨脹、斷裂，使蛋白的持水性增強，黏度增大[14]。本文以養殖大黃魚肌原纖維蛋白和絲氨酸蛋白酶為對象，由于魚糜凝膠需加熱制備，因此首先探討絲氨酸蛋白酶的最適溫度及pH，可避免長時間在此溫度附近逗留以致破壞凝膠特性，并進一步研討NaCl對絲氨酸蛋白酶活性的影響。在此基礎上再探究NaCl對添加絲氨酸蛋白酶后肌原纖維蛋白凝膠特性的影響，為后期控制魚糜凝膠劣化，提高魚糜凝膠特性提供一些理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

養殖大黃魚，購于寧波路林市場；NaCl、乙醇、叔丁醇、Na2HPO4、NaH2PO4、HCl,國藥集團化學試劑有限公司；Tris，Solarbio有限公司；Boc-Phe-Ser-Arg-MCA，Peptide Institute；戊二醛、7-氨基-4-甲基香豆素，麥克林試劑有限公司；DEAE-Sephacel，上海基星生物科技有限公司；Phenyl-Sepharose，北京博爾西科技有限公司。

1.2 儀器與設備

TA-XT Plus 物性分析儀，美國FTC公司；Avanti J-26XP冷凍離心機，美國貝克曼庫爾特有限公司；KTA pure LI 蛋白純化層析儀，GE Healthcare Uppsala Sweden；色差計，上海源琦檢測儀器有限公司；恒溫水浴鍋，上海一恒科學儀器有限公司；ALPHA2-4冷凍干燥儀，上海繼譜電子科技有限公司；In Via-Reflex拉曼光譜儀，法國Renishaw公司；F-380內源熒光分光光度計，天津港東科技發展股份有限公司；S-4800場發射掃描電子顯微鏡，日本日立公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 原料預處理

養殖大黃魚去頭、去尾、去鱗、去內臟等，淋洗干凈，瀝干取肉，-20 ℃冰箱保存待用。

1.3.2 肌原纖維蛋白的提取

參照CHIN等[15]和JIANG等[16]的研究，稍作修改，取適量魚糜，加入4倍體積冰提取液(20 mmol/L，pH 7.5磷酸鹽緩沖液)，高速勻漿機均漿60 s(7 500 r/min)，將所得的勻漿液冷凍離心10 min(7 000 r/min，4 ℃)，除去上清液。重復3次。得到粗肌原纖維蛋白再加入4倍體積冰洗液(0.1 mol/L NaCl)，均漿60 s(7 500 r/min)，離心10 min，取沉淀。重復1次上述實驗，最后一次勻漿液用3層紗布過濾，以7 000 r/min冷凍離心10 min，取沉淀，-40 ℃冷凍保藏。

1.3.3 絲氨酸蛋白酶的分離純化

(1)絲氨酸蛋白酶粗提取

參照鮑曉瑾[17]的方法，并略做修改。將冷凍魚糜解凍完全后取適量于離心管中，加入4倍體積的pH 7.5，25 mmol/L磷酸鹽緩沖液，高速勻漿機8 000 r/min勻漿30 s，4 ℃、8 000×g離心10 min，去上清液，取沉淀，重復上述方法4次，最后得到無腥味、半透明狀的沉淀。沉淀中加入pH 7.5，25 mmol/L的磷酸鹽緩沖液(含0.5 mol/L KCl，1 mmol/L MgCl2，5 mmol/L Na3PO3)，高速勻漿后靜置30 min，紗布過濾，收集濾液，加入15倍體積的冷蒸餾水，4 ℃下靜置過夜，離心后取沉淀，即為肌原纖維[7]。所得肌原纖維與2 mol/L的KCl混合，調整pH至4.0，靜置2 h，離心取沉淀。將所得沉淀以1∶5加入2 mol/L的KCl，混合離心去上清液，即絲氨酸蛋白酶粗酶液。透析48 h，冷凍干燥，-40 ℃貯藏，待用[18]。

(2)DEAE-Sephacel離子交換層析

參照翁凌等[19]的方法，將粗酶溶于少量pH 7.5， 20 mmol/L的Tris-HCl溶液，10 000 r/min 4 ℃下離心10 min，取上清液。將上清液上樣于平衡后的DEAE-Sephacel柱子(2.5 cm×11 cm)，用含0～0.5 mol/L NaCl的20 mmol/L pH 7.5的Tris-HCl緩沖液梯度洗脫，收集各組分并測定A280值。對收集溶液進行酶活測定，選取活性部分。

(3)Sephacryl S-100凝膠層析

參照蔡秋鳳等[20]的方法，將收集的活性部分樣品上樣于平衡后的Sephacryl S-100凝膠柱(1.5 cm×60 cm)，用含1 mol/L (NH4)2SO4的20 mmol/L pH 7.5的Tris-HCl緩沖液梯度洗脫，測定各組分A280值及酶活，收集高活性部分的溶液。

1.3.4 絲氨酸蛋白酶的活性測定

絲氨酸蛋白酶酶活測定參照CAO等[21]、鮑曉瑾[17]的方法進行測定，并略作修改。以Boc-Phe-Ser-Arg-MCA為底物檢測絲氨酸蛋白酶的酶活，取850 μL的50 mmol/L pH 7.5的Tris-HCl緩沖液于10 mL的離心管中，加入100 μL 100 mmol/L的熒光底物，再加入50 μL的絲氨酸蛋白酶液，55 ℃下反應10 min，立即加入終止液[V(甲醇)∶V(正丁醇)∶V(蒸餾水)=35∶30∶35]，室溫下靜置15 min，內源熒光光度計測量其熒光強度，設置發射波長為380 nm，激發波長為470 nm。Tris-HCl緩沖液作為空白對照，絲氨酸蛋白酶酶活以1 min生產1 μmol Boc-cys(AMC)所需的絲氨酸蛋白酶來表示一個酶活單位。

標準曲線測定，配制標準品AMC為10 μmol/L，將標準品按0、1、2、3、4、5 μmol/L配制成標準曲線，用熒光分光光度計在激發波長380 nm，發射波長470 nm下測定熒光值，每個濃度測3次[22]。得到標準曲線為Y=2.016 1x+0.390 6。

1.3.5 絲氨酸蛋白酶最適溫度測定

以Boc-Phe-Ser-Arg-MCA為底物，取100 μL底物，50 μL酶于離心管中，分別置于20～70 ℃水浴鍋內，參照2.4方法測定酶活。

1.3.6 絲氨酸蛋白酶最適pH測定

以Boc-Phe-Ser-Arg-MCA為底物，取100 μL底物，50 μL酶于離心管中，以pH為5、6、7、8、9、10的Tris-HCl緩沖液作為反應介質，參照2.4方法測定酶活。

1.3.7 不同NaCl添加量對絲氨酸蛋白酶活性影響

以Boc-Phe-Ser-Arg-MCA為底物，取100 μL底物，50 μL酶于離心管中，分別添加0、10、20、30、40 g/L NaCl后，參照2.4方法測定酶活。

1.3.8 添加絲氨酸蛋白酶的肌原纖維蛋白凝膠制備

取5 g肌原纖維蛋白于離心管中，分別加入含0、10、20、30、40 g/L NaCl的磷酸鹽緩沖液(pH 7.5，20 mmol/L)，再加入上述提取的絲氨酸蛋白酶100 μL，均質5 min，置于水浴鍋中大約以1 ℃/min的升溫速度從20 ℃升到70 ℃，加熱30 min后立即取出，置于4 ℃冰箱冷藏過夜，測定肌原纖維蛋白凝膠特性前先將樣品至于室溫下平衡1 h[6]。

1.3.9 質構測定

取養殖大黃魚肌原纖維蛋白凝膠樣品于質構儀載物臺上，參照許艷順等[23]的方法，將養殖大黃魚魚糜凝膠的腸衣剝去，切成2 cm左右的厚度，置于質構儀載物臺上，采用P/25探頭，應變力為0.1 N，測試速度為60 mm/min，形變量為50%，室溫下完成測定。

1.3.10 持水性測定

肌原纖維蛋白凝膠的持水性測定參照顏偉華等[24]的方法并略做修改，取養殖大黃魚肌原纖維蛋白凝膠于離心管內離心10 min(4 ℃、8 000 r/min)，離心前樣品質量為W1，離心后樣品質量為W2，凝膠持水性計算如公式(1)所示：

(1)

1.3.11 白度測定

將養殖大黃魚魚糜凝膠樣品切成5 mm左右的薄片，在室溫下用色差計測定凝膠白度，白度計算公式參照PARRARAVIVAT等[25]的方法，如公式(2)所示：

(2)

式中：L*，亮度；+a*，偏紅，-a*，偏綠；+b*，偏黃，-b*,偏藍。

1.3.12 拉曼光譜測定

養殖大黃魚肌原纖維蛋白凝膠樣品采用拉曼光譜分析，參考張自業[26]的方法。將制備好的肌原纖維蛋白凝膠樣品置于載玻片上，選擇50倍長聚焦鏡頭對肌原纖維蛋白樣品進行聚焦。檢測參數為所用功率為100 mW，532 nm氬離子激光器，分辨率為1 cm-1，獲取的拉曼光譜范圍在400～4 000 cm-1。

1.3.13 內源熒光測定

將肌原纖維蛋白凝膠溶于pH 7.5，20 mmol/L的磷酸鹽緩沖液中，配制成0.2 mg/mL的肌原纖維蛋白凝膠溶液，選擇激發波長為280 nm，發射波長為300～450 nm，狹縫寬度為5 nm[27]。

1.3.14 微觀結構觀察

參照許艷順[28]的方法，并略做修改。將養殖大黃魚魚糜凝膠切成整齊的塊狀置于塑料培養皿中，加入一定量的戊二醛，于4 ℃下固定24 h，用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液漂洗3～5次，再用不同含量的乙醇及無水乙醇叔丁醇混合溶液(3∶1、1∶1、1∶3)、乙醇、叔丁醇漂洗，最后冷凍干燥，噴金，掃描觀察。

1.4 數據處理

所有試驗均平行3次，數據采用Excel軟件作圖，SPSS Statistics軟件進行單樣本T檢驗(n=3)、顯著性分析及組間相關性分析，不同小寫字母表示具有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 絲氨酸蛋白酶的分離純化

研究發現，魚肉中存在的內源性絲氨酸蛋白酶會使肌原纖維蛋白凝膠重鏈發生降解[7]。養殖大黃魚肉經過提取、透析、凍干得到的粗酶，再經過DEAE-Sephace分離純化結果如圖1-a所示，從圖中可以看出，有許多無活性的雜蛋白。在NaCl濃度為0.2～0.25 mol/L，有活性的絲氨酸蛋白酶被洗脫下來，收集活性部分進行下一步純化。取活性部分收集液上樣于Sephacryl S-100凝膠層析柱，這一步主要是根據樣品分子質量大小而達到分離目的。樣品經過Sephacryl S-100凝膠柱分離純化結果如圖1-b所示，Sephacryl S-100凝膠柱有效的除去了大部分雜蛋白，使目標蛋白的純度增加。選擇高吸光值的酶活性峰，收集活性組分。

2.2 絲氨酸蛋白酶的最適溫度

由圖2可知絲氨酸蛋白酶的最適溫度在20～70 ℃，絲氨酸蛋白酶的相對活力隨溫度的上升呈先顯著增大后顯著減小的趨勢(P<0.05)。當溫度達到50 ℃時，酶活最大。這與魚糜凝膠在50～55 ℃發生凝膠劣化的溫度一致，當溫度升到70 ℃時，絲氨酸蛋白酶的酶活顯著降低，僅為最大活性的59.98%(P<0.05)。

2.3 絲氨酸蛋白酶的最適pH值

由圖3可知，當pH增大時，絲氨酸蛋白酶的相對活力先隨之增大，pH為7時相對酶活最大(P<0.05)，繼續增大pH，相對酶活減小。當pH為5時，絲氨酸蛋白酶的相對酶活為最大酶活的60.86%，當pH達到10時，絲氨酸蛋白酶的相對活性僅為最大酶活的51.51%。過高或過低的pH都不利于絲氨酸蛋白酶的活性，可能是由于酶的結構與構象發生變化，影響活性區域，使酶活降低[29]。

a-DEAE-Sephace；b-Sephacryl S-100；

圖2 絲氨酸蛋白酶的最適溫度

圖3 絲氨酸蛋白酶的最適pH值

2.4 不同NaCl添加量對絲氨酸蛋白酶活性的影響

不同NaCl添加量對絲氨酸蛋白酶的活性影響如圖4所示，由圖4可知，隨著NaCl添加量(質量濃度)的增大，絲氨酸蛋白酶的相對活性顯著下降(P<0.05)，空白組的絲氨酸蛋白酶活性最大，隨著NaCl質量濃度的增多，絲氨酸蛋白酶的相對活性逐漸降低，40 g/L NaCl組的活性相對最小，為72.03%(P<0.05)。

圖4 不同NaCl添加量(質量濃度)對絲氨酸蛋白酶活性的影響

2.5 NaCl對添加絲氨酸蛋白酶后肌原纖維蛋白凝膠質構特性的影響

為了研究NaCl對添加絲氨酸蛋白酶后肌原纖維蛋白凝膠質構特性的影響，利用質構儀對肌原纖維蛋白凝膠的質構特性進行分析，由表1可知，NaCl組的養殖大黃魚肌原纖維蛋白凝膠的質構特性優于空白組，隨著NaCl添加量的增多，凝膠硬度先顯著上升后顯著下降(P<0.05)，20 g/L NaCl添加量組凝膠硬度最大，之后隨著NaCl添加量的增多，硬度又略有下降(P<0.05)。研究發現，鹽濃度可以改變環境中的離子強度，蛋白的電荷分布及蛋白在溶液中的狀態，使蛋白之間的相互作用發生變化，影響到蛋白的凝膠特性[30]。并且NaCl降低絲氨酸蛋白酶的活性，減弱其對肌原纖維蛋白的降解，從而使肌原纖維蛋白凝膠的硬度增大。在NaCl添加量為0～20 g/L時，蛋白凝膠的黏附性不斷增大(P<0.05)，繼續增大NaCl的質量濃度，凝膠黏附性又顯著減小(P<0.05)，當NaCl質量濃度為40 g/L時，凝膠的黏附性最大，為0.065 mJ。隨著NaCl質量濃度的增多，養殖大黃魚肌原纖維蛋白凝膠的內聚性先顯著增大(P<0.05)，當NaCl質量濃度達到30 g/L時，凝膠的內聚性最大(P<0.05)，繼續增大NaCl的質量濃度，凝膠的內聚性又略有減小(P<0.05)。在NaCl質量濃度為0～20 g/L，凝膠彈性不斷顯著增大(P<0.05)，當NaCl質量濃度為30、40 g/L時，肌原纖維蛋白凝膠的彈性增大不明顯(P>0.05)。在NaCl質量濃度為0～20 g/L，肌原纖維蛋白凝膠的膠黏性、咀嚼性不斷上升(P<0.05)，20 g/L NaCl質量濃度組凝膠膠黏性、咀嚼性最大，繼續增多NaCl的添加量，蛋白凝膠的膠黏性、咀嚼性又略有下降(P>0.05)。

表1 NaCl對添加絲氨酸蛋白酶后肌原纖維蛋白凝膠質構特性的影響

2.6 NaCl對添加絲氨酸蛋白酶后肌原纖維蛋白凝膠持水性的影響

圖5是NaCl對添加絲氨酸蛋白酶后肌原纖維蛋白凝膠持水性的影響。由圖5可知，隨著NaCl添加量的增多，凝膠持水性顯著增大(P<0.05)。與空白組相比，NaCl組凝膠持水性顯著增大(P<0.05)，在NaCl質量濃度為40 g/L時，肌原纖維蛋白凝膠的持水性最好。研究表明，適量的NaCl會提高溶液環境里的離子強度，使凝膠形成更加均勻的網絡狀結構，凝膠孔徑小，更容易保留住凝膠中的水分[31]。韓敏義[32]在研究肌原纖維蛋白結構與熱誘導凝膠功能特性的關系中發現，隨著NaCl質量濃度的增加，凝膠持水性不斷增加。絲氨酸蛋白酶會對肌球蛋白重鏈造成降解，而NaCl抑制了酶活性，減輕其對肌原纖維蛋白凝膠的破壞，故添加了NaCl后，肌原纖維蛋白凝膠的持水性大于空白組。

圖5 NaCl對添加絲氨酸蛋白酶后肌原纖維蛋白凝膠持水性的影響

2.7 NaCl對添加絲氨酸蛋白酶后肌原纖維蛋白凝膠白度的影響

由表2可知，NaCl對添加絲氨酸蛋白酶后肌原纖維蛋白凝膠白度的影響。空白組中凝膠白度值最小，隨著NaCl添加量的增多，凝膠白度不斷上升，20 g/L NaCl添加量的凝膠白度最大，為54.35。而30 g/L NaCl添加量的白度值下降，40 g/L NaCl添加量組的凝膠白度略小于20 g/L NaCl添加量組，為53.19。研究發現，白度變化與蛋白質發生結構改變、變性，展開或聚集等情況有關[33]。若魚糜凝膠的空間網絡結構變得更加緊密，其表面可以反射出更多的光，以此提高養殖大黃魚魚糜的白度[34-35]。由此可見，NaCl的添加可能導致肌原纖維蛋白結構轉變、凝膠空間結構更加致密，從而導致白度上升。

表2 NaCl質量濃度對添加絲氨酸蛋白酶后肌原纖維蛋白凝膠白度的影響

2.8 NaCl對添加絲氨酸蛋白酶后肌原纖維蛋白凝膠二級結構的影響

對添加了絲氨酸蛋白酶的肌原纖維蛋白凝膠進行拉曼測定，結果如圖6所示。

圖6 NaCl對添加絲氨酸蛋白酶后肌原纖維蛋白凝膠拉曼光譜的影響

2.9 NaCl對添加絲氨酸蛋白酶后肌原纖維蛋白凝膠構象的影響

NaCl對添加絲氨酸蛋白酶后肌原纖維蛋白凝膠內源熒光強度的影響如圖7所示。由圖7可知，空白組中肌原纖維蛋白凝膠的熒光強度最大，10 g/L NaCl組的凝膠熒光強度與空白組之間幾乎無差別，30、40 g/L組與空白組相差較小。20 g/L NaCl組的熒光強度最低，說明在添加20 g/L NaCl后，可能使肌原纖維蛋白凝膠體系的蛋白結構有所改變，蛋白展開，使內部的色氨酸殘基暴露于表面，從而導致熒光強度下降。賈娜等[37]研究表明，豬肉糜中肌原纖維蛋白凝膠的熒光強度與NaCl質量濃度的增加未曾體現規律性變化。但當NaCl與迷迭香提取物協同作用，肌原纖維蛋白內源熒光強度明顯下降。

2.10 NaCl對添加絲氨酸蛋白酶后肌原纖維蛋白凝膠微觀結構的影響

圖8是NaCl對添加絲氨酸蛋白酶后肌原纖維蛋白凝膠微觀結構的影響，由圖8可知，空白組中肌原纖維蛋白凝膠的網絡結構雜亂無序，凝膠斷裂嚴重。添加了10 g/L NaCl后，凝膠的結構聚集程度稍微增強，空隙較小。且隨著NaCl添加比例的增大，蛋白凝膠結構越來越緊密穩定，孔徑越來越小，且致密有序、平整，凝聚度較高，致密有序的結構有助于持水能力的增強。研究表明，原肌纖維蛋白溶解度隨著離子強度的升高而增大，肌原纖維蛋白變性展開更充分，這有利于形成更為致密的三維網狀結構，可以吸附包裹更多的水分[26]。賈丹[38]研究發現，CaCl2的添加對魚糜凝膠網狀結構也有一定的改良效果。未添加 CaCl2的青魚和鰱魚糜凝膠的網絡結構孔隙較大，添加40 mmol/kg CaCl2的魚糜凝膠的孔隙較小，結構均較致密。

a-空白組;b-10 g/L NaCl組;c-20 g/L NaCl組;d-30 g/L NaCl組;e-40 g/L NaCl組

2.11 添加與未添加絲氨酸蛋白酶的肌原纖維蛋白凝膠相關性分析

將肌原纖維蛋白凝膠及添加絲氨酸蛋白酶后的肌原纖維蛋白凝膠的質構特性、白度、持水性的參數進行相關性分析，得到的結果如表3所示。由表3可知，肌原纖維蛋白凝膠與添加絲氨酸蛋白酶后的肌原纖維蛋白凝膠具有一定的相關性，運用皮爾森相關性進行分析，發現肌原纖維蛋白凝膠的質構特性與添加絲氨酸蛋白酶后的肌原纖維蛋白凝膠的質構特性具有極強的相關性且二者之間的相關性系數分別為0.984、0.977、0.850、0.900、0.944、0.852；而在添加相同含量NaCl中，肌原纖維蛋白凝膠、添加絲氨酸蛋白酶后的肌原纖維蛋白凝膠持水性的相關性系數為0.723，具有中度相關性；此外二者之間的白度值相關性較低，為0.449。研究結果表明，絲氨酸蛋白酶會破壞肌原纖維蛋白凝膠特性，添加絲氨酸蛋白酶與未添加絲氨酸蛋白酶的肌原纖維蛋白凝膠經過不同含量NaCl處理后，未添加絲氨酸蛋白酶的肌原纖維蛋白凝膠性質較好，說明絲氨酸蛋白酶會造成肌原纖維蛋白凝膠劣化，而NaCl在一定程度上抑制了絲氨酸蛋白酶的活性，減輕肌原纖維蛋白凝膠劣化，因此，在不同NaCl添加量組中，NaCl不僅可以促進魚糜發生凝膠化，還可以抑制魚糜中內源性絲氨酸蛋白酶的活性。

表3 添加與未添加絲氨酸蛋白酶的肌原纖維蛋白凝膠的皮爾森相關性檢驗

3 結論

本實驗研究了不同NaCl添加量(質量濃度)對絲氨酸蛋白酶及含有絲氨酸蛋白酶的肌原纖維蛋白凝膠特性的影響，研究發現：

(1)通過對絲氨酸蛋白酶的最適溫度、pH值的研究，發現絲氨酸蛋白酶的最適溫度為50 ℃，最適pH值為7。NaCl組的絲氨酸蛋白酶的活性相較與空白組的酶活性低，隨著NaCl添加量的增多，絲氨酸蛋白酶的活性顯著下降。

(2)隨著NaCl添加量的增多，含有絲氨酸蛋白酶的肌原纖維蛋白凝膠的質構特性有所改善，20 g/L NaCl添加量組的硬度、膠黏性、咀嚼性最大，40 g/L添加量組的黏附性、彈性較好。添加NaCl后，肌原纖維蛋白凝膠持水性有顯著性提高，NaCl添加量為40 g/L時，蛋白凝膠的持水性最大，為44.58%。添加NaCl后，肌原纖維蛋白凝膠的白度值總體上升，NaCl添加量為20 g/L時，凝膠白度最大。

(3)添加NaCl后，含有絲氨酸蛋白酶的肌原纖維蛋白凝膠二級結構發生變化，α-螺旋減少，β-折疊、無規則卷曲增多，通過內源熒光光譜分析發現，蛋白凝膠三級結構發生改變，蛋白空間結構展開。隨著NaCl添加量的增多，肌原纖維蛋白凝膠的微觀網絡結構越來越緊密。

(4)通過皮爾森相關性分析，發現添加與未添加絲氨酸蛋白酶的肌原纖維蛋白凝膠經不同含量NaCl處理后的凝膠特性具有一定的相關性，研究發現，NaCl本身可以改善肌原纖維蛋白凝膠特性，在此基礎上進一步研究發現NaCl降低了絲氨酸蛋白酶的活性，一定程度上阻止了酶對肌原纖維蛋白凝膠的破壞。