二氧化氯氣體對葡萄鏈格孢菌的抑制作用

康慧芳，喬勇進，劉晨霞,張怡，孫大鵬，仝瀟洋

1(上海市農業科學院,農產品保鮮加工研究中心，上海， 201403)2(上海師范大學 生命科學學院，上海， 200235)3(上海農產品保鮮加工工程技術研究中心，上海， 201403)4(內蒙古農業大學 食品科學與工程學院, 內蒙古 呼和浩特，010018)

葡萄為葡萄科(Vitaceae)葡萄屬植物，落葉藤本，果實營養豐富、味甜多汁、富含香味，集食療價值、醫用價值[1]、美容價值和商業價值于一身，深受廣大消費者青睞。然而葡萄是不耐貯藏水果之一，果實皮薄肉軟，采后極易受病原微生物侵染[2]，由此造成了巨大的經濟損失。其中，交鏈孢霉腐病是葡萄果實最為突出的采后病害之一，主要致病菌為鏈格菌(Alternariaalternata)，其對生態環境的適應能力強，生長繁殖快，嚴重影響寄主的質膜透性、酶活性、激素平衡及其他生理代謝過程，從而造成果實大量腐爛[3-4]。

二氧化氯氣體(ClO2)是一種安全高效的氧化性滅菌消毒劑，目前已被眾多國家廣泛應用于食品生產、飲用水、醫療器械、室內污染、公共衛生等方面的消毒殺菌[5-9]。目前已有大量研究表明,ClO2可以抑制或滅活細菌或真菌，可用于果蔬的保鮮，而關于ClO2對鏈格孢菌的研究鮮有報道。

本文將采用不同濃度的ClO2對離體鏈格孢菌和活體鏈格孢菌處理不同的時間，以不做任何處理作為對照處理，探索ClO2對葡萄鏈格孢菌的影響。通過測定與菌體相關的指標，研究ClO2對鏈格孢菌的抑制作用及抑菌機理，并在葡萄果實上接種驗證，旨在為ClO2在葡萄貯藏保鮮中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗所用的葡萄品種為“巨峰”，購于上海市奉賢區嘉園路87號水果店，挑選色澤、大小一致，且無機械損傷、無病蟲害的果實，購買當天裝在水果泡沫箱中運回冷庫預冷并貯藏于(4±0.5)℃的冷庫中。葡萄鏈格孢菌來源于華東師范大學生命科學學院，馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar，PDA)培養基中,4 ℃冰箱保存。

穩定性ClO2溶液(氯酸鹽溶液及檸檬酸顆粒)購于國藥化學試劑有限公司；ClO2母液的配制：取氯酸鹽溶液10.0 mL，加入1.0 g活化劑，反應2 min后加入蒸餾水定容至1 000 mL，即為ClO2母液，現用現配。

乙酸、無水乙酸鈉、鄰苯二酚、H2O2、愈創木酚、吐溫-80、PDA培養基、無水乙醇、聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone, PVPP)、Triton X-100(均為分析純)，國藥集團化學試劑有限公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒，南京建成科技有限公司。

1.2 儀器與設備

Ultrospec 3300pro酶標儀,美國安馬西亞公司；HVE-50高壓蒸汽滅菌鍋,日本托米公司；CA-1480超凈工作臺,上海上凈凈化設備有限公司；D37520 Osterode高速冷凍離心機,德國Biofuge公司；DHG-9240A電熱恒溫鼓風干燥箱,上海益恒實驗儀器有限公司；打漿機,廣東美的生活電器制造有限公司；SPX-250 B-Z生化培養箱，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；XB-K-25血球計數板,上海求精生化儀器有限公司；IX71-A21PH倒置顯微鏡,日本奧林巴斯有限公司；GT-903泵吸式二氧化氯檢測儀,深圳市科爾諾電子科技有限公司;CRR-001高精度配氣儀,北京康爾興科技發展有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 孢子懸浮液的制備

采用LACHHAB等[10]的方法，將鏈格孢菌接種在PDA培養基上，在環境為(25±1)℃恒溫培養箱中培養7 d待菌絲長出，再用直徑為0.6 cm的打孔器在培養皿邊緣補位取5個菌碟置于加入10 mL含0.05%(體積分數)吐溫-80無菌水的50 mL小燒杯中, 充分攪拌10 min洗孢子，經雙層紗布過濾至另一個離心管中，再加入5 mL無菌水，用紅血球計數板計數，用無菌水將菌懸液中孢子濃度調整至1×106個/mL，備用。

1.3.2 實驗處理

1.3.2.1 實驗原理

ClO2處理葡萄鏈格孢菌的離體菌和活體菌的操作原理如下：將ClO2母液配制好倒置于透明塑料箱中密封放置一段時間，待氣體大量產生時接通塑料管道，將氣體緩慢輸入配氣儀，并通過調節配氣比例,輸出連續、穩定的標準氣體濃度，并將氣體輸入到含有鏈格孢菌菌懸液的PDA培養基或者接種了鏈格孢菌葡萄的密閉塑料箱中，同時塑料箱的另一端用塑料管連接ClO2測定儀，當測定儀達到所需濃度時頃刻關閉配氣儀并啟動計時表。操作過程均在超凈工作臺進行，且操作前用75%(體積分數)酒精將塑料箱、高精度配氣儀及ClO2測定儀擦拭3遍，后于超凈工作臺紫外殺菌過夜。另外在實驗前要根據所需氣體濃度，不斷嘗試并設定可短時間內達到該氣體濃度的配氣比例為正式試驗做準備。ClO2濃度計算如公式(1)所示，公式(1)由深圳市科爾諾電子科技有限公司提供。

ClO2濃度=配氣儀顯示值(ppm)×67.46×22.4

(1)

式中：ClO2濃度單位為mg/m3，1 mg/m3=1 μg/L；67.46為ClO2分子質量；22.4為特定系數。

1.3.2.2 離體實驗

取20 μL菌懸液滴在PDA培養基中心，室溫條件下放置4 h后放入消毒特制密閉箱中，在室溫(25±1)℃、空氣濕度為85%的條件下通入ClO2，使箱內ClO2濃度分別達到1.5、3.0、4.5、6.0、7.5、9.0 μg/L，且處理時間分別為10、20、30 min,然后置于(25±1)℃的生化培養箱中培養，以不做任何處理作為對照處理，每天測定1組數據，直至對照組(CK組)菌落長滿培養皿。以6個培養皿為1個處理，每個處理設計3個重復。

1.3.2.3 活體接種實驗

選擇外觀整齊、無病蟲害和機械損傷的番茄果實，用自來水將果面沖洗干凈，然后用0.2%(體積分數)的次氯酸鈉溶液浸泡2 min，接著用75%(體積分數)酒精浸泡1 min，再用無菌水沖洗3次，晾干后用無菌剪刀剪下葡萄果實(保留果梗)后，用直徑2 mm的滅菌接種針在果實赤道部刺傷(深度3 mm)，滴入10 μL的菌懸液，室溫條件(20±1)℃下放置在上述特制密閉箱中4 h后，分別用3.0、6.0、9.0 μg/L的ClO2處理30 min，以在密閉箱中不通入ClO2為對照處理。每2 d測定1組數據，第10天時測定其落果率、果梗腐爛率以及失重率3項指標。每個處理組取200粒葡萄，設置3個重復。

1.3.3 指標測定

1.3.3.1 ClO2對鏈格孢菌菌絲生長的抑制作用

用十字交叉法統計每天鏈格孢菌的菌落直徑(cm)，用第6天時的菌落直徑來計算菌絲生長抑制率。菌落生長抑制率計算如公式(2)所示：

菌落生長抑制率/%

(2)

1.3.3.2 鏈格孢菌菌絲狀態倒置顯微鏡觀察

分別在PDA培養基中滴入20 μL濃度為1×106個/mL的鏈格孢菌菌懸液，超凈工作臺放置4 h后通入質量濃度為1.5、3.0、4.5、6.0、7.5、9.0 μg/L的ClO2處理10、20、30 min，不做任何處理設為對照組(CK組)，放置在25 ℃的恒溫培養箱中培養。24 h后用無菌刀在中央位置取2 cm×2 cm×2 cm的培養基小塊，制成玻片在倒置顯微鏡下觀察并拍照，每個玻片取不同的7個視野觀察并拍照，每組設置3個重復。

1.3.3.3 ClO2對鏈格孢菌芽管伸長的抑制作用

將離體菌如1.3.3.2處理，25 ℃培養箱培養24 h后，在倒置顯微鏡下觀察并用顯微鏡上的測量尺測量每組芽管的長度(μm)并記錄，計算芽管生長抑制率。芽管生長抑制率計算如公式(3)所示：

芽管伸長抑制率/%

(3)

1.3.3.4 ClO2對鏈格孢菌孢子萌發的抑制作用

將上述培養6 d后的鏈格孢菌用直徑為0.6 cm的打孔器在培養皿邊緣取3個菌碟，無菌水洗孢子并用托馬計數池進行計數，每組處理重復3次，通過公式(4)計算孢子萌發抑制率：

(4)

1.3.3.5 ClO2體對葡萄果實病害和貯藏品質的影響

每3 d統計病斑直徑及病斑率，病斑直徑采用十字交叉法，取平均值；病斑直徑若>0.5 mm,則確定為發病，發病率計算如公式(5)所示：

(5)

1.3.3.6 抗性酶活力的測定

過氧化物酶(peroxidase，POD)活性采用愈創木酚法測定；多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)活性采用鄰苯二酚比色法測定；MDA含量、CAT、SOD活性采用試劑盒測定。

1.4 數據處理

實驗數據運用Excel 2007和 Origin 8.0 軟件對數據進行處理分析,P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著，P>0.05為差異不顯著。

2 結果與分析

2.1 ClO2對鏈格孢菌菌絲體的影響

由表1可知，與對照組相比，各濃度ClO2處理對鏈格孢菌菌絲生長均有不同程度的抑制作用，且隨著ClO2濃度的增加及時間的延長，對鏈格孢菌菌絲生長的抑制效果也逐漸增強，其中9.0 μg/L ClO2處理組的抑制率顯著大于其他各組(P<0.05)，培養第6天, 9.0 μg/L ClO2處理10 min和20 min時菌絲抑制率分別達到50.13%和84.88%，而9.0 μg/L ClO2處理30 min的培養皿從第1天～第6天，均未見菌絲長出，可能在滴取孢子懸浮液后并進行氣體處理時，9.0 μg/L ClO2在30 min內將鏈格孢菌的孢子全部殺死，因此在培養過程中，沒有孢子可以萌發乃至長出菌絲。

表1 ClO2對鏈格孢菌菌落生長的抑制作用

2.2 ClO2對鏈格孢菌芽管伸長的抑制作用

由圖1可知，滴有鏈格孢菌孢子液的培養皿經不同濃度ClO2處理并培養24 h后，與對照組相比，ClO2處理對鏈格孢菌芽管伸長均有不同程度的抑制作用。隨著ClO2濃度的增加和時間的延長，芽管伸長抑制率基本呈上升趨勢，其中9.0 μg/L ClO2處理10 min時，芽管伸長抑制率高達87.59%，顯著高于其他各組(P<0.05)，而9.0 μg/L ClO2處理20、30 min時均未有孢子萌發，未見芽管伸長。

2.3 ClO2對鏈格孢菌孢子萌發的抑制作用

如圖2所示，培養皿經不同濃度ClO2處理并在28 ℃生化培養箱中培養6 d后，經0.05%(體積分數)吐溫-80和無菌水清洗并觀察計算，發現ClO2處理組對鏈格孢菌孢子萌發均有不同程度的抑制作用，且鏈格孢菌孢子萌發抑制率和ClO2濃度以及處理時間基本成正比，ClO2濃度越大，處理時間越長，鏈格孢菌的孢子萌發抑制率越大，其中9.0 μg/L ClO2處理20 min，抑制率高達96.67%，顯著高于其他處理組(P<0.05)，而9.0 μg/L ClO2處理30 min時，6 d內均未見菌絲生長，鏈格孢菌孢子萌發抑制率是100%。

圖1 ClO2對鏈格孢菌芽管伸長的抑制作用

圖2 ClO2對鏈格孢菌孢子萌發的抑制效果

2.4 ClO2對鏈格孢菌菌絲形態的影響

如圖3所示，與對照組相比，經ClO2處理培養的鏈格孢菌菌絲密集程度顯著下降，且ClO2處理組的菌絲表面粗糙且出現溝壑。而對照組的菌絲相當密集，有很多孢子在菌絲間長出，邊緣菌絲稀疏處可以觀察到菌絲表面光滑，緊密環繞。由此說明ClO2處理對鏈格孢菌孢子有一定失活效果，且對菌絲造成了很大損傷，高濃度可能會造成菌絲斷鏈。

A-對照處理;B-9.0 μg/L ClO2處理-10 min

2.5 ClO2對葡萄果實發病率的影響

如圖4所示，各組葡萄接種鏈格孢菌后逐漸開始染病，接種第2天～第8天，ClO2處理組的果實發病率顯著低于對照組(P<0.05)，接種第10天，CK組和3.0 μg/L ClO2處理組發病率均達到100%，而9.0 μg/L ClO2處理30 min時僅為47.71%，顯著低于其他各組(P<0.05)，綜上說明質量濃度為9.0 μg/L的ClO2處理30 min能顯著降低葡萄采后交鏈孢霉腐病的發病率。

圖4 ClO2對葡萄發病率的影響

2.6 ClO2對葡萄果實中MDA含量的影響

如圖5所示，接種鏈格孢菌后，葡萄果實內的MDA含量均呈上升趨勢，這是由于果實損傷導致。經ClO2處理的果實MDA含量均低于對照處理，從第2天開始，9.0 μg/L ClO2處理30 min時果實中的MDA含量均顯著低于其他各組(p<0.05)，貯藏至第10天，9.0 μg/L 30 min處理組的MDA含量僅為 9.84 nmol/g，低于對照組4.83 nmol/g。說明經質量濃度為9.0 μg/L的ClO2處理葡萄能有效減緩果實內部自由基對細胞膜的損傷。

2.7 ClO2體對葡萄果實中POD和PPO活性的影響

由圖6-A可知，葡萄接種鏈格孢菌后，貯藏期間各組果實的POD活性均呈先上升后下降的趨勢，對照組和9.0 μg/L ClO230 min處理組的POD活性在貯藏第4天達到高峰，而6.0 μg/L和9.0 μg/L ClO230 min處理組的POD活性均在第6天才達到高峰，且后者POD活性峰值顯著大于前者(P<0.01)，9.0 μg/L ClO230 min處理組的POD活性值顯著大于其他各組(P<0.05)，貯藏至第10天，該處理組的POD活性值為0.45 U/g，是對照組的2.14倍，說明9.0 μg/L ClO230 min 處理組能促使果實保持較高的POD活性。

由圖6-B可知，各組果實中的PPO活性均在上升和下降中來回波動，前4 d貯藏期間，各組果實的PPO活性值基本趨于下降趨勢，其中9.0 μg/L ClO230 min 處理組的PPO活性顯著大于其他各組(P<0.01)，第4天開始，各組PPO活性值均逐漸上升，第8天，9.0 μg/L ClO2處理組達到了最大值，PPO活性值為3.81 U/g，是對照組的3.97倍，接著出現下降趨勢，但貯藏至第10天，9.0 μg/L ClO2處理組的PPO活性值依然居于首位，達到 2.61 U/g。綜上說明經質量濃度為9.0 μg/L的ClO2處理能夠更快的誘導果實PPO活力的上升，并促使PPO活力保持較高水平。

A-POD活性；B-PPO活性

2.8 ClO2對葡萄果實中 CAT和SOD活性的影響

SOD是漿果中普遍存在的抗氧化酶類，它能將超氧陰離子歧化為H2O2和O2，從而起到清除活性氧、維持活性氧平衡、保護膜結構的作用[11-12]。如圖7-A所示，接種鏈格孢菌后，各組果實SOD活性均呈先下降后上升，后期回降的趨勢，而9.0 μg/L ClO230 min 處理組的活性值一直顯著高于其他各組(P<0.05)。貯藏前6 d，各組SOD活性值均呈下降趨勢，其中9.0 μg/L ClO230 min 處理組的活性值一直居于首位，第8天，各組SOD活性值均出現峰值，其中9.0 μg/L ClO230 min 處理組的SOD活性值最高，為43.86 U/g，是對照組的1.37倍。貯藏至第10天，9.0 μg/L ClO230 min 處理組的SOD活性值依然居于首位，為33.89 U/g，顯著高于其他各組(P<0.01)。綜上說明果實經質量濃度為9.0 μg/L的ClO2處理30 min時能保持較高的SOD活性。

CAT 是果實后熟衰老中的保護性酶類，它能催化果蔬體內積累的H2O2分解，從而減少H2O2對果蔬組織造成的傷害[13-14]。由圖7-B可知，夏黑葡萄接種鏈格孢菌后，各組果實CAT活性均在下降與上升的趨勢之間波動，貯藏第6天，各組CAT活性達到了峰值，其中9.0 μg/L ClO230 min處理組的CAT活性值顯著高于其他各組(P<0.01)，第6天開始各組CAT活性值開始下降，其中9.0 μg/L ClO230 min處理組下降速度相對比較緩慢，而第8天后開始上升，貯藏到第10天，9.0 μg/L ClO230 min處理組的CAT活性值依然居于首位，值為2.69 U/g，高于對照組0.96 U/g。由此表明，應用9.0 μg/L的ClO2處理夏黑葡萄30 min，能夠有效減緩H2O2的清除效率，延緩CAT活性的降低。

A-SOD活性；B-CAT活性

3 討論

研究不同濃度ClO2對離體鏈格孢菌的抑制效果，結果表明ClO2濃度越大，處理時間越長，抑制效果越好。韋明肯等[15]研究發現ClO2可以氧化氨基酸使蛋白質變性，進而對果蔬起到殺菌消毒的作用。本實驗采用菌絲生長速率法和孢子萌發法測定了不同濃度ClO2對鏈格孢菌的影響，結果發現，隨著ClO2濃度的增大和時間的延長，離體鏈格孢菌的抑制效果越來越好，9.0 μg/L的ClO2處理離體菌10 min時，芽管伸長抑制率為87.58%，孢子萌發抑制率為88.33%，菌落生長抑制率高達50.13%，各項指標都顯著高于其他各組(P<0.05)，且在高倍顯微鏡下觀察，鏈格孢菌菌絲內部細胞質凝集，菌絲空洞化、發黑變粗、萎縮，而9.0 μg/L的ClO2處理30 min時，整個培養期間都未見菌絲長出。由此可見在起初處理時間內，9.0 μg/L的ClO2殺死了鏈格孢菌的孢子，導致后期沒有孢子萌發乃至菌絲長出。

病原菌侵染葡萄漿果后，SOD、CAT、POD以及電子傳遞相關的PPO等組成了一個有效的活性氧自由基清除系統，能有效維持自由基在植物體內產生和清除的動態平衡，保持膜結構的完整性，增強果實抵抗病害的能力[16-17]。9.0 μg/L ClO2密閉熏蒸接種后的葡萄果實30 min，能夠在貯藏期間有效保持較高的PPO和POD活性，貯藏到第10天，PPO活性值是對照組的1.67倍，POD活性值是對照組的2.10倍。研究結果與集賢等[18]研究ClO2溶液對接種灰霉菌的采后葡萄進行處理，可增強果實抗性這一結果類似。且9.0 μg/L ClO2處理組能夠有效減緩果實內部自由基對細胞膜的損傷，這一結果與前面果實貯藏期間能保持較好的抗氧化性結果相互對應。另外，9.0 μg/L ClO2處理組可以有效抑制果實CAT活性的降低和果實腐爛率的升高，貯藏到第10天，CAT活性值高于對照組0.96 U/g。同時，9.0 μg/L ClO2處理組還能夠保持較高的SOD活性，對抗與阻斷因氧自由基對果實細胞造成的損害，并及時修復果實受損細胞，延緩交鏈孢霉腐病對漿果的損害。

4 結論

ClO2能夠有效抑制離體鏈格孢菌的菌絲生長、芽管伸長以及孢子萌發，并對鏈格孢菌菌絲造成損傷，且ClO2濃度越高，處理時間越長，抑菌效果越好。當鏈格孢菌的孢子濃度為1×106個/mL時，9.0 μg/L ClO2處理30 min可完全抑制孢子的萌發。

ClO2處理降低了接種鏈格孢菌葡萄果的發病率，減少了果實內MDA含量的積累，維持了較高的PPO和POD活性，且CAT和SOD活性在接種病原菌后一直保持顯著高于對照組的水平，有效維持自由基在植物體內產生和清除的動態平衡，增強果實抵抗鏈格孢菌的侵染能力，其中效果最好的處理組是9.0 μg/L ClO2處理30 min。