添加葡萄糖及大豆源基質提高紅曲monacolin K產量的研究

石佳，張紅梅，蘇子杰，徐方，余翔1,2,3,，馮艷麗1,2,3,*

1(食用野生植物保育與利用湖北省重點實驗室(湖北師范大學)，湖北 黃石，435002)2(生物學國家級實驗教學示范中心(湖北師范大學)，湖北 黃石，435002)3(特色野菜良種繁育與綜合利用技術湖北省工程研究中心，湖北 黃石，435002)4(湖北師范大學 生命科學學院，湖北 黃石，435002)

紅曲菌(Monascusspp.)是我國傳統的特色可食用真菌資源，紅曲菌發酵大米等淀粉質原料所得的產品——紅曲，在我國已有2 000多年的應用歷史[1]。紅曲菌的有益代謝產物主要包括紅曲色素(Monascuspigments, MPs)、莫納可林K(monacolin K, MK)及γ-氨基丁酸等[2]。其中，MPs可按顏色分為紅色素、黃色素和橙色素三類[1]。MPs主要用于發酵豆制品、紅曲米酒及干制魚、肉制品等的著色，保健食品及替代肉品加工中的部分亞硝酸鹽等[2-3]。MK可有效抑制膽固醇生物合成中關鍵酶3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A(3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A，HMG-CoA)還原酶的活性，進而調節血脂水平[4]。目前，市場銷售的功能性紅曲主要指通過紅曲菌發酵淀粉質原料等獲取的含MK等有益次級代謝產物的紅曲產品[4]。

目前，生產功能性紅曲的淀粉質原料除大米外，還有大豆、薏米及燕麥等[5-6]。可采用響應面法等優化紅曲發酵工藝條件，如培養基配方、發酵溫度、pH等提高發酵產物中MK的含量[7-8]。前期研究發現，在大米培養基中添加大豆粉可顯著提高紅曲菌發酵產物中MK的含量(P<0.05)[9]。然而，大豆粉含有過敏原Gly m Bd60K即β-伴大豆球蛋白的β亞基，且豆粉中的油脂也易氧化造成紅曲產品出現哈敗味，進而影響含大豆原料紅曲類產品的品質和產品推廣[10-11]。另有研究表明，大豆中相關組分如大豆異黃酮及亞油酸等對紅曲菌生長及代謝產物的產生有顯著影響[12-13]。然而，大豆粉中促進MK產生的關鍵組分并不清楚。因此，難以在充分利用大豆粉促進紅曲菌產生MK的同時避免其過敏原及脂質氧化等問題。因大豆粉中含有豐富的蛋白質，可作為紅曲發酵的優質氮源[14]。另一方面，在固態培養基中補充適量速效碳源——葡萄糖，也可促進紅曲菌生長及代謝產物生成[15]。由此，也將大豆分離蛋白和葡萄糖作為研究對象加以探討。

結合已有的研究基礎，本研究以可高產 MK但不產桔霉素的叢毛紅曲菌(Monascuspilosus)MS-1為實驗菌株，考察葡萄糖及大豆中幾種組分對紅曲菌固態發酵產MK的影響，以期篩選獲得可促進紅曲菌產MK的組分，進而獲得高MK含量的功能性紅曲。該研究結果可為利用葡萄糖或大豆中某些組分生產高MK含量的功能性紅曲提供理論及技術支持，還可為采用某一種或某幾種組分替代大豆粉在功能性紅曲中的應用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株

叢毛紅曲菌(M.pilosus)MS-1(CCTCC M 2013295，中國典型培養物保藏中心)，市售紅曲米中分離獲得。

1.1.2 原料

大豆異黃酮(純度為60%)、大豆卵磷脂、大豆分離蛋白，河南華悅化工產品有限公司；大米及大豆，市售。

1.1.3 溶液及試劑

MK標準品(純度≥98%)，阿拉丁公司；色譜純乙腈及常規試劑如葡萄糖、H3PO4、蛋白胨、瓊脂、冰醋酸、NH4H2PO4、CaCl2、MgSO4·7H2O、無水乙醇，國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.4 儀器與設備

安捷倫1260型高效液相色譜儀，Agilent科技有限公司；其他設備均為常規設備。

1.1.5 培養基

PDA培養基：稱取200 g去皮后的馬鈴薯，切成約2 cm3的小塊。加入約1 000 mL蒸餾水后煮沸約20 min。用紗布過濾后將濾液定容至1 000 mL。加入20 g葡萄糖和15 g瓊脂粉并加熱使其充分溶解。自然pH，在1×105Pa滅菌20 min。

種子液培養基(g/L)：葡萄糖80、蛋白胨10、無水CaCl20.1、NH4H2PO42、MgSO4·7H2O 0.5，以土豆汁(PDA不添加葡萄糖和瓊脂)定容。pH值為6.0，分裝后于1×105Pa滅菌20 min。

固態發酵天然培養基：將50 g細度為20 目的大米加入250 mL三角瓶中，分別調整培養基含水量、冰醋酸及MgSO4·7H2O添加量為35%(質量分數)、0.6 mL/100g和0.004 mol/kg，充分混勻，1×105Pa滅菌20 min后趁熱打散備用。

1.2 實驗方法

1.2.1 紅曲發酵產物中MK的測定

紅曲發酵產物中MK的測定參考已建立的方法進行[9]。在50 mL的離心管中加入0.3 g粉碎后的紅曲固態發酵產物和10 mL 體積分數為75%的乙醇，充分振蕩混勻后超聲提取1 h。提取液在8 000 r/min離心10 min，所得上清液過0.22 μm濾膜后采用高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)法測定紅曲發酵產物中MK的含量。HPLC系統為Agilent 1260，色譜柱為InertsilODS-3(250 mm×4.6 mm，5 μm)。流動相為V(乙腈)∶V(水)∶V[0.5%(體積分數)H3PO4]=60∶37∶3，流速1 mL/min，柱溫25 ℃，檢測波長238 nm，進樣量20 μL。紅曲發酵產物中MK含量計算如公式(1)所示：

MK/(mg·g-1)=

(1)

1.2.2 種子液的制備

將紅曲菌接種于PDA培養基斜面，30 ℃培養10 d。以無菌水沖洗PDA上的紅曲菌孢子并調整孢子濃度為106CFU/mL。以10 mL/100g的接種量將紅曲菌孢子接入1.1.5所述種子液培養基中，在30 ℃、120 r/min培養48 h。

1.2.3 大豆分離蛋白、大豆異黃酮及大豆卵磷脂對紅曲菌產MK的影響

為考察大豆分離蛋白、大豆異黃酮及大豆卵磷脂對紅曲菌固態發酵產MK的影響，以大米為對照，在以大米為主要基質的培養基中添加1%(質量分數)的上述添加物，將培養基含水量、MgSO4·7H2O及冰醋酸添加量分別調整至35%(質量分數)，0.004 mol/kg和0.6 mL/100g，接入13 mL/100g(質量分數)紅曲菌種子液，在30 ℃條件下培養60 h后轉入25 ℃繼續培養至14 d。所得發酵產物在55 ℃烘干12 h并粉碎備用。采用HPLC分析MK的含量，具體方法同1.2.1。

1.2.4 大豆異黃酮添加量對紅曲菌產MK的影響

為確定大豆異黃酮的最適加入量，向大米培養基中添加大豆異黃酮并分別將其添加量調整為0.5%、1%、3%、5%、10%、15%(質量分數)，以不添加大豆異黃酮的處理為對照。發酵條件及發酵產物處理同1.2.3，發酵產物中MK含量的測定方法同1.2.1。

1.2.5 大豆分離蛋白添加量對紅曲菌產MK的影響

為確定大豆分離蛋白的最適加入量，向大米培養基中添加大豆分離蛋白并分別將其添加量調整為1%、3%、5%、7%、9%(質量分數)，以不添加大豆分離蛋白的處理為對照。發酵條件及發酵產物處理同1.2.3，發酵產物中MK含量的測定方法同1.2.1。

1.2.6 葡萄糖添加量對紅曲菌產MK的影響

為確定葡萄糖的最適添加量，向大米培養基中添加葡萄糖并分別將其添加量調整為1%、3%、5%、7%、9%(質量分數)，以不添加葡萄糖的處理為對照。發酵條件及發酵產物處理同1.2.3，發酵產物中MK含量的測定方法同1.2.1。

1.2.7 大豆異黃酮、大豆分離蛋白及葡萄糖復合對紅曲菌產MK的影響

為探究大豆異黃酮、大豆分離蛋白及葡萄糖復合對MK產生是否有協同作用，分別向大米培養基中添加3%大豆異黃酮、5%大豆分離蛋白、3%葡萄糖、3%大豆異黃酮和5%大豆分離蛋白、3%大豆異黃酮和3%葡萄糖、5%大豆分離蛋白和3%葡萄糖、3%大豆異黃酮和5%大豆分離蛋白及3%葡萄糖(質量分數,全文同)，以純大米培養基作為對照。發酵條件及發酵產物處理同1.2.3，發酵產物中MK含量的測定方法同1.2.1。

1.2.8 大豆分離蛋白復合葡萄糖替代大豆粉用于含MK的功能性紅曲發酵的驗證實驗

在1.2.7的實驗結果基礎上，分別以大米添加5%大豆分離蛋白復合3%葡萄糖、大米復合豆粉，質量比為3∶2 作為培養基，以純大米培養基為對照。發酵條件及發酵產物處理同1.2.3，發酵產物中MK含量的測定方法同1.2.1。

2 結果與分析

2.1 大豆分離蛋白、大豆異黃酮及大豆卵磷脂對紅曲菌產MK的影響

考察大豆分離蛋白、大豆異黃酮及大豆卵磷脂對紅曲菌固態發酵產MK的影響，測定紅曲菌發酵14 d所得發酵產物中MK的含量，結果如圖1所示，大豆分離蛋白和大豆卵磷脂對紅曲菌產MK均有顯著促進作用，而大豆異黃酮則顯著抑制MK的產生(P<0.05)。研究表明，大豆異黃酮可促進紅曲菌生物量的增加，還可影響紅曲菌菌絲的形態，進而影響其代謝產物的產生。然而，大豆異黃酮并非促進紅曲菌所有代謝產物的產生，如大豆異黃酮可促進MPs產生，但卻抑制桔霉素的產生[12]。因此，大豆異黃酮對紅曲菌代謝產物產生的影響具有選擇性，這與本研究中得到的結果即大豆異黃酮可促進MPs產生卻抑制MK產生相符(有關MPs的具體數據未列出)。另外，大豆異黃酮的添加量也可影響紅曲菌生長及代謝產物產生，需進一步優化。研究表明，在培養基中添加豆粉可顯著促進紅曲菌產生MK，大豆粉中除該研究涉及的3種組分外還有哪些組分參與該過程，仍待進一步研究[9]。由于大豆卵磷脂對MK的影響不及大豆分離蛋白顯著，且其對MPs的產生也無顯著影響，暫不作深入探討。

圖1 大豆分離蛋白、大豆異黃酮及大豆卵磷脂對紅曲菌產MK的影響

2.2 大豆異黃酮添加量對紅曲菌產MK的影響

為考察大豆異黃酮添加量對紅曲菌產MK的影響，以未添加大豆異黃酮的處理為對照，接種紅曲菌后培養14 d，檢測發酵產物中MK的含量，結果如圖2所示。當大豆異黃酮添加量達到3%、5%和10%時，對MK的產生均有顯著促進作用(P<0.05)。大豆異黃酮的添加量達到3%時MK產量可達對照的3.10倍。除添加0.5%大豆異黃酮的處理外，1%、15%添加量的大豆異黃酮均可顯著抑制MK產生(P<0.05)。推測大豆異黃酮添加量為0.5%時，難以在培養基中混勻并起效。

因此，大豆異黃酮的添加量對MK的產生影響顯著，即添加1%大豆異黃酮可顯著抑制MK的產生而添加3%大豆異黃酮則顯著促進MK的產生。工業上用于生產MK的菌株不同或同一菌株在不同條件下可選擇性產生某種主要代謝產物如MPs或MK[16]。因此，在對某實驗菌株的發酵條件進行優化時，應考慮該菌株的具體發酵特性。

圖2 大豆異黃酮添加量對紅曲菌產MK的影響

2.3 大豆分離蛋白添加量對紅曲菌產MK的影響

為分析大豆分離蛋白添加量對紅曲菌產MK的影響，以不添加大豆分離蛋白的處理為對照，接種紅曲菌并培養14 d，檢測發酵產物中MK的含量，結果如圖3所示，添加1%及以上大豆分離蛋白即可顯著促進MK的產生。大豆分離蛋白的添加量達到5%時MK的產量達到最高，為對照的17.19倍(P<0.05)，該結果與圖1的結果相符。當大豆分離蛋白的添加量達到7%及以上，MK的產量下降。大豆分離蛋白作為優質氮源，對紅曲菌的生長和代謝均有影響。然而，當培養基中氮源含量過高時，可造成碳氮比失衡，反而不利于菌體的生長及代謝產物的產生[17]。

圖3 大豆分離蛋白添加量對紅曲菌產MK的影響

2.4 葡萄糖添加量對紅曲菌產MK的影響

為分析葡萄糖添加量對紅曲菌產MK的影響，以不添加葡萄糖的處理為對照，接種紅曲菌后培養14 d，檢測發酵產物中MK的含量，結果如圖4所示，在培養基中添加葡萄糖可顯著抑制紅曲菌產MK(P<0.05)，且葡萄糖添加量與MK產量呈負相關。根據前期研究結果和查閱文獻可知，葡萄糖更利于MPs的產生(與本研究得到的有關MPs的數據相符，未列出)，尤其利于黃色素的產生[15]。然而，葡萄糖可促進紅曲菌快速生長進而提升生物量，為抑制雜菌并促進代謝產物積累奠定良好的基礎[18]。因此，在該研究中將繼續考察葡萄糖與其他添加物復合對紅曲菌產MK的影響。

圖4 葡萄糖添加量對紅曲菌產MK的影響

2.5 大豆異黃酮、大豆分離蛋白及葡萄糖復合對紅曲菌產MK的影響

為分析大豆異黃酮、大豆分離蛋白及葡萄糖兩兩復合對紅曲菌產MK的影響，以大米培養基為對照，接種紅曲菌后培養14 d，檢測發酵產物中MK的含量，結果如圖5所示，5%大豆分離蛋白和3%葡萄糖復合對紅曲菌產MK有協同促進作用(P<0.05)。結合前述結果，在培養基中添加5%大豆分離蛋白可顯著促進MK產生，添加3%葡萄糖卻可顯著抑制MK的產生(P<0.05)。究其原因，推測是大豆分離蛋白和葡萄糖可分別被紅曲菌用作氮源和碳源，同時添加上述物質可獲取更適合紅曲菌產MK的碳氮比，或是兩者結合解除了葡萄糖的碳代謝抑制[17]。

圖5 大豆異黃酮、大豆分離蛋白及葡萄糖復合對紅曲菌產MK的影響

2.6 大豆分離蛋白復合葡萄糖替代大豆粉用于含MK功能性紅曲發酵的驗證實驗

為驗證大豆分離蛋白復合葡萄糖替代豆粉對紅曲菌產MK的影響，以大米培養基為對照，將紅曲菌接種于上述3種培養基培養14 d，分析發酵產物中MK的含量，結果如圖6所示，在大米培養基中添加豆粉或大豆分離蛋白復合葡萄糖，均可顯著促進MK的產生，這與已有的研究結果相符(P<0.05)[9]。添加5%大豆分離蛋白復合3%葡萄糖比添加豆粉更利于MK的產生，其MK產量分別為添加豆粉和對照所得MK產量的1.53倍和16.80倍。

該結果可為用大豆分離蛋白復合葡萄糖替代豆粉在高MK含量功能性紅曲中的應用奠定基礎。該研究可避免因直接使用豆粉造成所生產的功能性紅曲中油脂含量過高而發生脂肪氧化，但無法避免潛在過敏源。

圖6 大豆分離蛋白復合葡萄糖、豆粉對紅曲菌產MK的影響

3 結論

紅曲菌是我國具有傳統特色的可食用微生物，其主要代謝產物MPs和MK在我國得到廣泛的應用。紅曲菌發酵大豆、豆粕、豆漿等均可獲取高MK含量的紅曲產品[19-20]。然而，大豆促進MK產生的具體組分并不清楚。本研究以大米為基礎培養基，考察經典碳源葡萄糖及大豆主要組分對紅曲菌產MK的影響。根據研究結果，在培養基中添加5%(質量分數)大豆分離蛋白復合3%(質量分數)葡萄糖，可促進紅曲菌發酵產物中MK的產生。在上述條件下，MK產量可達12.85 mg/g，高于添加大豆粉的處理所得紅曲發酵產物中MK的產量。該研究結果可為利用經典碳源葡萄糖復合大豆分離蛋白生產高MK含量的功能性紅曲產品提供理論和技術支持。尤其是可考慮采用葡萄糖復合大豆分離蛋白替代大豆粉應用于功能性紅曲的生產中，以此減少因直接使用豆粉造成的紅曲產品中脂類的氧化變質等問題。